DepositadaCompreende um substrato para o cultivo de células-tronco pluripotentes, o qual é gerado a partir da fixação por etanol de células de fibroblastos fetais de camundongo, e o processo de obtenção do mesmo. A invenção tem o objetivo de estabelecer um substrato com a complexidade necessária para garantir pelo menos 95% das células mantidas pluripotentes. Além disso, o uso de camadas de células alimentadoras é substituído, as condições de cultivo são mantidas e a contaminação com moléculas animais pela matriz é eliminada, sendo um substrato de baixo custo e compatível com a demanda científica nacional

Rehen, Stevens Kastrup

Stelling, Mariana Paranhos

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(21 ) PI 1103059-3 A2 11 111 1 1 1111 * R P I O 3 O 5 9 A 2 * República Federaliva do Brasil U,mi.llil~~J <11.:.> ÚR~l'-f''l:h!\~n1Y'l:o ln~l~ml! iil (22) Data de Depósito: 06/06/2011 (43) Data da Publicação: 1211112013 (RPI 2236) (51) lnt.CI.: C12N 5/0735 (54} Título: PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE UM SUBSTRATO DE CULTIVO PARA CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES E SUBSTRATO DE CULTIVO PRODUZIDO PELO MESMO (73} Titular(es}: Universidade Federal do Rio de Janeiro (72) lnventor(es): Mariana Paranhos Stelling, Stevens Kastrup Rehen (57) Resumo: PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE UM SUBSTRATO DE CULTIVO PARA CÉLULAS TRONCO PLURIPOTENTES E SUBSTRATO DE CULTIVO PRODUZIDO PELO MESMO. O presente pedido de patente de invenção compreende um substrato para o cultivo de células-tronco pluripotentes, o qual é gerado a partir da fixação por etanol de células de fibroblastos fetais de camundongo. e o processo de obtenção do mesmo. A invenção tem o objetivo de estabelecer um substrato com a complexidade necessária para garantir pelo menos 95% das células mantidas pluripotentes. Além disso, o uso de camadas de células alimentadoras é substituido, as condições de cultivo sào mantidas e a contaminação com moléculas animais pela matriz é eliminada, sendo um substrato de baixo custo e compatível com a demanda científica nacional. 5 1/10 PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE UM SUBSTRATO DE CULTIVO PARA CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES E SUBSTRATO DE CULTIVO PRODUZIDO PELO MESMO Campo da invenção: O presente pedido de patente descreve um substrato de cultivo processo produtos para de para células-tronco embrionárias humanas e seu obtenção, o qual se pesquisa científica destina ao campo na área biológica de e possui potencial para futuro uso na clínica médica. 10 A invenção pode ser utilizada para todos os tipos de 15 células pluripotentes (embrionárias e induzidas), tanto murinas quanto humanas. Também pode ser produzido em larga escala, gerando produtos de baixa perecibilidade. Fundamentos da técnica: A manutenção das características das células-tronco pluripotentes demanda o uso de substratos complexos, tais como camadas de células alimentadoras de fontes animais ou extratos completos de matriz extracelular. Tais substratos permitem o crescimento celular e sua 20 manutenção funcional, porém, ao mesmo tempo, contaminam as células-tronco com moléculas imunogênicas que podem causar problemas em casos de transplantes. As principais formas de produzir substratos de cultivo para células-tronco embrionárias são a matriz produzida in 25 loco, matrigel e proteínas purificadas. A matriz produzida in loco e o matrigel consistem em substratos completos de matriz extracelular, enquanto as proteínas purificadas representam um substrato específico, que contém apenas um ou dois tipos de moléculas presentes. 30 A matriz produzida in loco consiste no cultivo de 2/10 células produtoras de matriz que, após produção da matriz, são lisadas e eliminadas, deixando o substrato livre de células vivas. Uma das maneiras mais comuns de realização deste procedimento é pelo tratamento químico com a amônia, 5 cuja função é eliminar o corpo celular e deixar o substrato apenas com as moléculas da matriz. No entanto, as moléculas não são fixadas ao substrato e são perecíveis, apresentando um curto período de uso. Para o cultivo específico de células-tronco pluripotentes humanas, tal substrato só pode 10 ser utilizado em combinação com outros fatores. O extrato de matriz em forma de gel é comercializado sob o nome de matrigel e consiste em uma mistura gelatinosa de proteínas, lipídios e carboidratos, que são produzidos por células de camundongo. O matrigel tem sido utilizado no 15 cultivo de células-tronco embrionárias humanas há cerca de uma década, porém também requer o uso combinado com outros fatores, o que o torna mais custoso. O uso de proteínas purificadas de matriz extracelular, como a laminina e a fibronectina, também requer condições 20 especiais de cultivo, uma vez que o substrato acelular produzido por proteínas purificadas não é tão rico quanto a matriz completa produzida pelo próprio fibroblasto. Células-tronco pluripotentes humanas são cultivadas em meio condicionado, os quais podem ser: 25 - Substrato celular (MEF - fibroblastos embrionários murinos) + FGF-2 (4 a Bng/mL) - Substrato acelular + FGF-2 (40 a lOOng/mL) Substrato acelular + FGF-2 (4 a 8ng/mL) + meio condicionado com MEF 30 Assim, pode-se observar que, quando o substrato de 3/10 cultivo é acelular, não há modelo de cultivo de células-tronco em baixa concentração de FGF-2 sem que haja o condicionamento do meio com MEF. A presente invenção descreve um substrato no qual as 5 camadas de células alimentadoras são substituídas por células de fibroblastos fetais de camundongo. Assim, obtém-se um substrato altamente eficiente, que apresenta baixo teor de contaminação cruzada, armazenamento simples e por longo período de tempo sem alteração das características, 10 além de baixo custo de produção. Estado da técnica: O documento de anterioridade US 2003175956 Al descreve um método que permite a proliferação indiferenciada de células-tronco em uma matriz extracelular fibroblástica com 15 meio nutriente adicionado de FGF, no qual o ambiente de crescimento não apresenta células alimentadoras. A matriz descrita neste documento só é eficiente se for utilizado um meio condicionado na presença de FGF-2 (5 ng/mL), enquanto que, no presente pedido, a matriz pode ser utilizada com 20 qualquer meio de cultivo próprio para células-tronco pluripotentes humanas. Além disso, o modo de preparo do substrato também é diferente, tratando-se de uma lise celular provocada pelo hidróxido de amônio. O documento de anterioridade CN 1986781 A revela um 25 método para o cultivo de células-tronco mesenquimais em um ambiente contendo uma matriz extracelular separado a partir de fibroblasto humano. Por outro lado, a invenção pleiteada neste pedido destina-se ao cultivo de células-tronco pluripotentes. 30 O documento europeu EP 2267116 Al se refere a um meio 4/10 nutriente, ausente de células alimentadoras e com pelo menos 80 ng/mL de FGF, para a proliferação indiferenciada de células-tronco pluripotentes. De acordo com o protocolo apresentado na EP, a adaptação celular na matriz ocorre 5 após 6 passagens (aproximadamente 42 dias), enquanto que, na presente invenção, apenas 2 passagens (cerca de 14 dias) são suficientes para a adaptação. Além disso, o substrato acelular ora descrito é composto de uma matriz completa gerada por fibroblastos. 10 O documento coreano KR 20080087264 A revela uma matriz de f ibroblasto de placenta para proliferação e aderência de células-tronco mesenquimais oriundas do cordão umbilical, enquanto que a presente invenção serve para o cultivo de células-tronco pluripotentes e a preparação do substrato é 15 diferente. o documento wo 2009079409 Al descreve um substrato de cultivo que compreende uma mistura de fibronectina e albumina (proteínas purificadas), o qual deve ser acrescido de altas concentrações de FGF-2 com a finalidade de manter 20 as características das células-tronco. O pedido brasileiro BR 0514778 A ensina um método para o cultivo de células-tronco humanas não diferenciadas em matriz enriquecida na ausência de células alimentadoras. As células-tronco são cultivadas em alta concentração de FGF-2 25 (40 a 100 ng/mL), enquanto que na presente invenção utiliza-se apenas 4 a 8 ng/mL de FGF-2. O pedido BR 0514641 A ensina a formação de uma matriz humanizada para cultura de células-tronco embrionárias compreendendo colágeno, fibronectina, vitronectina e 30 laminina, com adição de fator de crescimento de fibroblasto 5 5/10 em uma concentração de pelo menos 40 ng / ml . No entanto, uma mistura de proteínas como descrito neste pedido não possui as mesmas características biológicas de uma matriz completa. Sumário da Invenção: O presente pedido de patente de invenção compreende um substrato para o cultivo de células-tronco pluripotentes, o qual é gerado a partir da fixação alcoólica de células de f ibroblastos fetais de camundongo, e o processo de obtenção 10 do mesmo. A invenção tem o objetivo de estabelecer um substrato com a complexidade necessária para garantir pelo menos 95% das células mantidas pluripotentes. Além disso, o uso de camadas de células alimentadoras 15 é substituído, as condições de cultivo são mantidas e a contaminação com moléculas animais advindas da matriz é eliminada, sendo um substrato de baixo custo e compatível com a demanda científica nacional. 20 Descrição das Figuras: As Figuras lA e lB são f otomicrograf ias que mostram a morfologia típica de colônias características de células-tronco pluripotentes sob condição controle (A) e MEF etanol (B), respectivamente. A Figura lC é um gráfico que demonstra o ritmo de 25 crescimento celular em ambas as condições de (A) e (B) . 30 As Figuras 2A, 2B, 2C e 2D são gráficos que mostram os níveis dos marcadores de pluripotência Oct-4, SOX-2, SSEA-4 e TRA-1-60, respectivamente, nas células-tronco cultivadas sob condição controle e MEF etanol. As Figuras 3A e 3B são fotomicrografias que mostram a 6/10 morfologia típica de corpos embrióides formados a partir de células-tronco cultivadas sob os substratos controle (A) e etanol (B) 1 respectivamente. A Figura 3C é um gráfico que analisa o diâmetro dos 5 corpos embrióides em ambas as condições de (A) e (B) . A Figura 4 é um gráfico que demonstra a quantificação dos níveis de ácido siálico Neu5Gc nas células-tronco. Descrição detalhada da invenção: o presente pedido de patente descreve um substrato de 10 cultivo para células-tronco embrionárias humanas, o qual é produzido pelo tratamento de fibroblastos de camundongo com etanol, que promove a li se celular e leva à fixação da matriz. o substrato ora descrito apresenta uma complexidade 15 mínima necessária para garantir pelo menos 95% das células mantidas pluripotentes, além de apresentar baixo custo e ser imunocompatível. 20 Processo de obtenção do substrato: o substrato desta invenção é obtido da seguinte forma: Etapa 1: As placas de petri próprias para o cultivo celular (ou seja, que apresentam superfície negativamente carregada) são rinsadas com uma solução O, 1% de gelatina estéril e colocadas abertas em fluxo laminar até a secagem do 25 líquido. Este passo tem a função de garantir a boa adesão das células a serem cultivadas à superfície da placa. Etapa 2: Prepara-se o meio de cultivo dos fibroblastos, o qual 30 con s i s te em: 5 7/10 - DMEM/F12 (meio base) - 10% soro fetal bovino - 2mM glutamina - 0,2% 2-mercaptoetanol Etapa 3: O criotubo contendo os f ibroblastos embrionãrios murinos é descongelado em banho-maria a 37°C com leve agitação manual por 1 a 2 minutos e, em seguida, são diluídas em meio de f ibroblasto na proporção de 1 parte de 10 meio de congelamento para 2 partes de meio de fibroblasto . 15 O material é centrifugado a 240 g por 5 minutos, o sobrenadante sendo descartado e o pellet (células) sendo suspenso novamente em meio de fibroblastos. Etapa 4: Os f i broblastos descongelados s ão plaqueados nas placas em uma densidade de 2,6xl04 célu las/cm2 e incubados a 37°C em 5% C02 por 48 horas. Etapa 5 : Após 48 h oras de incubação, as placas cultivadas s ã o 20 rinsadas com água estéril, com volume suficiente para cobrir toda a s uper fície da placa. Etapa 6: A água é aspira da e aplica- se o mesmo volume de etanol 70%, d e ixando- s e a placa tampada no f luxo laminar por 5 25 minutos à temperatura ambiente, sendo o etanol aspirado em seguida. E t ap a 7: A p l aca é novame nte rinsada c om etanol 70%, aspirada e seca dest ampada em fluxo lami nar por aproximadament e 5 a 10 30 minutos . 8/10 Etapa 8: A placa é selada com paraf ilm ou guardada em embalagem estéril e acondicionada a 4ºC por até 2 meses ou a temperatura ambiente por até 1 semana. 5 Ainda, para armazenamentos mais longos {superior a 2 meses), a placa deve ser acondicionada com solução de etanol 70% a -20°C. Etapa 9: Para utilização da placa para o cultivo de células-10 tronco pluripotentes, deve-se deixar a placa atingir a temperatura ambiente e plaqueá-la. Em caso de células-tronco embrionárias murinas, o meio deve ser complementado com o fator LIF (mesma concentração utilizada para o cultivo sobre camadas alimentadoras 15 inativadas). Para células-tronco embrionárias humanas, o uso do fator FGF-2 na concentração de 8 ng/mL é suficiente para a manutenção das características das células, mas pode-se utilizar concentrações superiores de acordo com o meio de 20 cultivo utilizado. Testes e resultados: - Quanto à morfologia e crescimento celular: As figuras lA e lB representam fotomicrografias em campo claro {escala 50µm) que mostram a morfologia típica 25 de col6nia característica das células-tronco pluripotentes. Células da linhagem H9 foram cultivadas sobre uma condição controle (A) e no substrato MEF etanol (B) aqui descrito. Conforme pode ser observado no grâf ico lC, o ritmo de 30 crescimento das c é lulas H9 não foi alterado ao se comparar 9/10 as condições controle e MEF etanol. Assim, comprova-se que as células-tronco pluripotentes humanas mantêm sua morfologia e ritmo de crescimento característicos no substrato MEF etanol. 5 - Quanto à pluripotência da cultura: A figura 2 ilustra graficamente a quantificação dos marcadores de pluripotência Oct-4 (A) e SOX-2 (B), através de fotomicrografias de imunomarcação das células-tronco pluripotentes, e a quantificação dos marcadores SSEA-4 (C) 10 e TRA-1-60 (D) através de análise por citometria. Isso significa que as células-tronco pluripotentes humanas da linhagem H9 mantêm altos níveis dos marcadores de pluripotência Oct-4, SOX-2, SSEA-4 e TRA-1-60 quando cultivadas por pelo menos 100 dias nas condições controle e 15 sobre o substrato MEF etanol. - Quanto à diferenciação em corpos embrióides: As figuras 3A e 3B representam fotomicrograf ias em campo claro (escala lOOµm) de corpos embrióides formados a partir de células H9 cultivadas sobre uma condição controle 20 (A) e no substrato MEF etanol (B) aqui descrito. Conforme pode ser observado no gráfico 3C, o diâmetro dos corpos embrióides formados não foi alterado ao se comparar as condições controle e MEF etanol. Assim, comprova-se que as células-tronco pluripotentes 25 humanas mantêm sua capacidade de diferenciação em corpos embrióides quando cultivadas no substrato MEF etanol. - Quanto ao nível de ácido siálico: A figura 4 ilustra graficamente a quantificação de imunomarcação do ácido siálico Neu5Gc por ci tometria das 30 células-tronco pluripotentes. 5 10/10 Conforme pode ser observado, as células H9 cultivadas sobre a condições controle apresentam mais células positivas (38%) para NeuSGc do que as células H9 cultivadas sobre o substrato MEF etanol (29%) . Além disso, f ibroblastos embrionários murinos (MEF) foram utilizados como controle positivo do experimento e apresentaram 64% de células positivas. Isso significa que as células-tronco humanas da linhagem H9 mantidas sobre o pluripotentes substrato MEF 10 etanol apresentaram menores níveis do ácido siálico não-humano Neu5Gc. 1 / 2 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a obtenção de um substrato de cultivo para células-tronco pluripotentes caracterizado por compreender as etapas de: a) rinsar as placas de petri com uma solução 0,1% de gelatina estéril e colocá- las abertas em fluxo laminar até a secagem; b) preparar o meio de cultivo dos fibrobl astos; c ) plaquear os fibroblastos nas placas e incubá-los a 37°C em 5% C02 por 48 horas; d) rinsar as placas com água estéril; e) aspirar a água e aplicar o mesmo volume de uma solução alcoólica, deixando-a tampada em fluxo laminar por 5 minutos à temperatura ambiente; f) aspirar a solução alcoólica e rinsar nov amente a placa com a solução; g) aspirar e secar a placa destampada em fluxo laminar por 5 a 10 minutos; h) armazenar a placa ou plaqueá-la. 2. Processo, conforme definido na reiv indicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução alcoólica é preferencialmente etanol 70% . 3. Processo, conforme definido na reiv indicação 1, caracterizado pelo fato de que o armazenament o da placa é feito por selagem da mesma com parafilm ou em embalagem estéril. 3. Processo, conforme definido na reivindi cação 1 , caracterizado pelo fato de que o armazenamento da p l aca é feito por acondicionamento da mesma a 4ºC por até 2 meses ou a temperatura ambiente por até 1 semana . 3 . Processo, conforme caracterizado pelo fato de 2/ 2 definido na reivindicação 1, que a placa ainda pode ser armazenada por períodos mais longos se acondicionada com solução de etanol 70% a -20ºC. 4. Substrato de cultivo para células-tronco pluripotentes caracterizado pelo fato de que é produzido pelo processo conforme em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3. 1/4 FIGURA lA ~e 1001 ~ 80 X N § - 60 V1 l'tJ "S •Q) 40 u Q) "'C o '-Q) 20. E ' ::l z o - • - Controle ~Etanol --1 2 Dias FIGURA lC FIGURA lB 3 4 5 2 /4 IJ\ 100 U'l 100 íl) ro > > ·_p 80 :.f2 80 .iíi U'l o o o. 60 o. 60 U'l U'l ~ 40 ~ 40 ::::l ::::l :ru 2{) ~ 20 (.) Q) Q) l::l o l::l o ~ -, ~ o o Controle Etanol Controle Etanol FIGURA 2A FIGURA 2B Vl 100 Vl 100 ro ro > 80 > ·.p ·.p 80 ·v; 'lii o fiO o 60 e. e. Vl 40 Vl IU ro 40 "3 "3 :m 20 :ã) 20 u u Q) o Q) o "C "C '/. Cont role Etanol '/. Controle Etanol FIGURA 2C FIGURA 20 e FIGURA 3A 500 ., controle •Etanol 3/4 FIGURA 3B .. .. FIGURA 3C 4/4 100 w (!) Ul 80 ::::i * Q) z 1 U1 rc 60 . > :.f! U1 o * o. 40 U1 rc :i ;w (.) Q) 20 "O ~ o o MEF Controle Etanol *p<0,05 hES hES FIGURA 4 5 1/1 Resumo PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE UM SUBSTRATO DE CULTIVO PARA CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES E SUBSTRATO DE CULTIVO PRODUZIDO PELO MESMO O presente pedido de patente de invenção compreende um substrato para o cultivo de células-tronco pluripotentes, o qual é gerado a partir da fixação por etanol de células de fibroblastos fetais de camundongo, e o processo de obtenção do mesmo. A invenção tem o objetivo de estabelecer um 10 substrato com a complexidade necessária para garantir pelo menos 95% das células mantidas pluripotentes . Além disso , o uso de camadas de células alimentadoras é substituído, as condições de cultivo são mantidas e a contaminação com moléculas animais pela matriz é eliminada , sendo um 15 substr ato de baixo custo e compatível com a demanda científica nacional. 

Processo para a obtenção de um substrato de cultivo para células-tronco pluripotentes e substrato de cultivo produzido pelo mesmo

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Processo para a obtenção de um substrato de cultivo para células-tronco pluripotentes e substrato de cultivo produzido pelo mesmo

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