Estudo da modulação das células mielóides supressoras no adenocarcinoma metastático após terapia antiangiogênica

Abstract

Renal cell carcinoma (RCC), the third leading cause of death in genitourinary cancers. RCCs are highly vascularized and resistant to radiotherapy and chemotherapy. Antiangiogenic drugs are promising and widely used in clinical, on the other hand, mechanism of evasive resistance has been seen to treatment with anti-VEGF antibody. Recent reports suggest that treatment resistance of patients with cancer is related to the presence of myeloid-derived suppressor cells. Endostatin (ES) is a fragment of collagen XVIII that mediates antiangiogenic activity, however, its mechanisms of action are unclear. In this study, we tracked Gr-1+ cells in different organs, evaluated the role of CD11b+Gr-1+ cells and their subsets during tumoral progression and examined the therapeutic potential of ES in modulating CD11b+Gr-1+ cells and their subsets as well as their immunosuppressive activities in lung metastasis. Healthy Balb/c mice were used to detect Gr-1+ cells. CCRm-bearing mice were nephrectomized on day 7 and collected metastatic lung, spleen and bone marrow after 3, 7 and 10 days. Quantification of CD11b+Gr-1+ cells and their monocytic and granulocytic subsets was performed by flow cytometry and microscopic analysis were viewed in HE staining. CCRm-bearing mice were treated with NIH/3T3-LendSN-clone 5 or with NIH/3T3-LXSN cells as a control. ES and G-CSF levels were measured by ELISA and Milliplex, respectively. Quantification of CD11b+Gr-1+ cells and their subsets was performed by flow cytometry. Gr-1+ cells magnetically separated were evaluated in vitro the nitrite levels in supernatant and arginase activity in cells by colorimetric assays. ROS production was measured in CD11b+Gr-1+ cells using the DCFDA marker by flow cytometry. Our data showed the presence of CD11b+Gr-1+ cells in the bone marrow as well as in the kidney, lung and spleen, confirming the monocytic and granulocytic morphologies In metastatic progression, saw the expansion of CD11b+Gr-1+ cells and, preferably, the granulocytic subtype in the bone marrow. Our data demonstrate the progressive accumulation of splenic CD11b+Gr-1+ cells and the opposite was seen in metastatic lungs.Gene therapy with ES reduced the number of pulmonary metastatic lesions, the number of CD11b+Gr-1+ cells and the number of granulocytic cells. G-CSF levels were also reduced and ROS production by granulocytic cells was affected after the treatment with ES. Here, we demonstrate that the metastatic progression is inversely proportional to the number of CD11b+Gr-1+ cells present in the tumor microenvironment, showing that the granulocytic subtype is involved in advanced metastasis. Treatment with ES induced relevant antitumor immune response abrogating the reduction of ROS-producing myeloid-derived suppressor cells in the metastatic local.O carcinoma de células renais (CCR) é a terceira causa de morte de câncer geniturinário. Esse câncer é altamente vascularizado e resistente a radioterapia e quimioterapia. As drogas antiangiogênicas são promissoras e amplamente utilizadas na clínica, porém mecanismo de resistência anti-tumoral tem sido desencadeado com o anticorpo anti-VEGF. Estudos relatam que a resistência ao tratamento de pacientes com câncer está relacionada à presença de células mielóides supressoras. A endostatina (ES) é um fragmento de colágeno XVIII que possui atividade antiangiogênica, porém seus mecanismos de ação não são elucidados. Nesse estudo, rastreamos células Gr-1+ em específicos órgãos do camundongo sadio, avaliamos a importância das células CD11b+Gr-1+ e seus subtipos durante a progressão metastática e examinamos o potencial da terapia com ES na modulação de células CD11b+Gr-1+ e em seus subtipos bem como a atividade imunossupressora na metástase pulmonar. Camundongos Balb/c sadios foram utilizados na detecção de células Gr-1+ separadas magneticamente. Camundongos Balb/c com CCRm foram nefrectomizados no dia 7 e coletados o pulmão metastático, baço e medula óssea após 3, 7 e 10 dias. A quantificação das células CD11b+Gr-1+ e os subtipos, monocítica e granulocítica, foi realizada por citometria de fluxo e análises microscópicas foram visualizadas em coloração de HE. Camundongos Balb/c com CCRm foram tratados com células NIH/3T3-LendSN-clone 5 ou com NIH/3T3-LXSN, como controle. A dosagem de ES foi realizada através de ELISA e do G-CSF através do milliplex. A quantificação de células CD11b+Gr-1+ e os subtipos foi realizada por citometria de fluxo. As células Gr-1+ separadas, magneticamente, foram avaliadas in vitro a dosagem de nitrito no sobrenadante e da atividade de arginase nas células, através de ensaios colorimétricos. E, a produção de EROs foi quantificada em células CD11b+Gr-1+ com o marcador DCFDA por citometria de fluxo. Nossos dados, mostraram a presença de células Gr-1+ tanto na medula óssea quanto no rim, pulmão e baço, confirmando as morfologias mononuclear e polimorfonuclear. No modelo de progressão metastática, verificamos a expansão de células CD11b+Gr-1+ e, preferencialmente, do subtipo granulocítica na medula óssea. Notamos o progressivo acúmulo de células CD11b+Gr-1+ no baço e o oposto nos pulmões metastáticos. A terapia gênica com ES induziu à redução de lesões metastáticas no pulmão, de células CD11b+Gr-1+ e do subtipo granulocítica. A redução dessas células foi refletida na diminuição dos níveis plasmáticos de G-CSF, levando à diminuição da produção de EROs pelas células granulocíticas. Assim, mostramos que a progressão metastática é inversamente proporcional ao número de células CD11b+Gr-1+ presentes no microambiente tumoral, mostrando que o subtipo granulocítica tem participação na metástase avançada. O tratamento com ES induziu uma resposta imune anti-tumoral prejudicando o recrutamento de células mielóides supressoras produtoras de EROs ao sítio metastático.Dados abertos - Sucupira - Teses e dissertações (2013 a 2016