Até recentemente a resistência às polimixinas era descrita como resultado de mutações cromossômicas, porém em novembro de 2015, foi relatada a resistência plasmidial às polimixinas mediada pelo gene mcr-1. A técnica de referência para determinar a suscetibilidade às polimixinas é a microdiluição em caldo, porém é uma técnica laboriosa, demorada para liberação dos resultados e relativamente cara. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram investigar a presença do gene mcr-1 em isolados de enterobactérias e estabelecer a caracterização molecular dos isolados positivos para o gene mcr-1, bem como avaliar diferentes metodologias para detecção da suscetibilidade às polimixinas frente a bactérias Gram-negativas. Foram avaliados 4778 isolados clínicos, obtidos entre os anos de 2013 e 2018, provenientes de um estudo de vigilância para o monitoramento de isolados com sensibilidade reduzida aos carbapenêmicos. A pesquisa do gene mcr-1 foi realizada através de PCR. Para os isolados positivos para o gene mcr-1 foi realizada a avaliação do perfil de suscetibilidade a diversos antibióticos, e em três isolados foi avaliada a capacidade de mobilidade plasmidial, através das técnicas de conjugação e transformação, bem como a realização do sequenciamento do genoma total em equipamento Illumina MiSeq. Diferentes metodologias foram avaliadas para determinar a suscetibilidade às polimixinas. Dentre elas, o Teste Rápido NP Polimixinas, os testes comerciais Policimbac® e Ágar superpolimixinas®, bem como modificações do teste de eluição da colistina (CBDE). Dos 4778 isolados clínicos analisados, 5 (0,1%) foram positivos para o gene mcr-1. Dentre os cinco isolados, três eram E. coli (3431F, 5798F e 6699F) e dois K. pneumoniae (3111F e 6701F), sendo todos coprodutores de mcr-1 e blaKPC-2. Os cinco isolados apresentaram resistência aos antimicrobianos ertapenem, meropenem, imipenem e ciprofloxacino, sensibilidade à tigeciclina e suscetibilidade variável aos aminoglicosídeos. Frente à colistina, todos isolados apresentaram baixo nível de resistência (CIM 4μg/mL), exceto o isolado K. pneumoniae 6701F que foi sensível (CIM 0,25 μg/mL). Dos 3 isolados (3431F, 3111F e 5798F) submetidos à técnica de conjugação foi demonstrado que o plasmídeo contendo o gene mcr-1 dos isolados foi transferido por conjugação para a cepa receptora E. coli J53. Através do sequenciamento do genoma pode-se observar que todos os genes mcr-1 estavam presentes em plasmídeo do grupo de incompatibilidade IncX4, sendo que E. coli 3431F pertencia à ST744; E. coli 5798F à ST457 e K. pneumoniae 3111F pertencia à ST437. O Teste Rápido NP Polimixinas apresentou alta sensibilidade (98%) e especificidade (98%) quando comparado ao método de referência (microdiluição em caldo), sendo que 88,7% dos isolados positivaram em menos de 2 horas. Já os testes comerciais Policimbac® e Ágar Superpolimixinas® obtiveram altos valores de sensibilidade (98% e 94,1%, respectivamente), porém com baixas especificidades, 77% para o Policimbac® e 75,4% para o Ágar Superpolimixinas®. As modificações (CBM, MPT e CSTT) do teste CBDE apresentaram bons valores de sensibilidade (95,35%, 88,37% e 93,02%, respectivamente) e especificidade (84%, 80% e 88%, respectivamente) para isolados de Enterobacterales, porém o valor de Erros Muito Importantes (Very Major Errors – VME – 4,65% para CBM; 11,63% para MPT e 6,98% para CSTT) e Erros Importantes (Major Errors – ME – 16% para CBM; 20% para MPT e 12% para CSTT) foram menos satisfatórios. Para isolados não fermentadores, nenhuma das modificações foi considerada aceitável, porém cabe mencionar que o número de isolados foi pequeno para estabelecer uma conclusão final. Este estudo contribuiu para o conhecimento molecular e epidemiológico dos isolados carreadores do gene mcr-1 no Rio Grande do Sul – Brasil, confirmando que todos os plasmídeos carreando o gene mcr-1 descritos no Brasil pertencem ao grupo de incompatibilidade plasmidial IncX4, o que indica a alta afinidade entre essa família plasmidial e o gene mcr-1 no país. Além disso, a descoberta de um isolado pertencente à ST437, a qual é considerada uma ST de alto risco pela elevada prevalência associada ao gene blaKPC no Brasil é de grande preocupação. Ademais, podemos constatar que a metodologia mais adequada como triagem na detecção da resistência às polimixinas seria o Teste Rápido NP Polimixinas, o qual dentre as metodologias testadas foi a que apresentou os melhores resultados, bem como a redução no tempo de detecção da resistência observada em comparação com o teste referência.Polymyxin resistance used to be related to chromosomal mutations, but in November 2015, the plasmid transferable polymyxin resistance, mediated by the mcr-1 gene, was described. The reference method for determining susceptibility profile to polymyxins is broth microdilution (BMD), however, it is laborious, times consuming and relatively expensive. The aims of this study were to investigate the presence of mcr-1 gene in enterobacterial isolates with reduced susceptibility to carbapenems in Rio Grande do Sul; to characterize to the molecular level the isolates harboring the mcr-1 gene and to evaluate differents polymyxins susceptibility tests against Gram-negative bacteria. We screened a total of 4,778 clinical isolates with reduced carbapenem susceptibility between 2013 and 2018 obtained in a surveillance study. The mcr-1 gene was screened by PCR reaction. The susceptibility profile to several antibiotics was evaluated for the mcr-1 positive isolates; three mcr-1 positive isolates were evaluated their plasmid mobility through conjugation and transformation techniques. These three isolates were also subjected to whole genome sequencing (WGS) carried out in an Illumina MiSeq plataform. Different methods were evaluated to determine susceptibility to polymyxins: the Rapid Polymyxins NP Test, the Policimbac®, Superpolymyxins® agar and the modification of the colistin broth disk elution (CBDE). Among the 4,778 clinical isolates analyzed, 5 (0.1%) were positive for the mcr-1 gene: 3 were E. coli (3431F, 5798F and 6699F) and 2 K. pneumoniae (3111F and 6701F). These 5 isolates were co-producers of the blaKPC-2 gene. All mcr-1 positive isolates were resistant to ertapenem, meropenem, imipenem and ciprofloxacin; susceptible to tigecycline and the susceptibility to aminoglycosides was variable. All isolates presented low level resistance to colistin (MIC 4μg/mL), except the K. pneumoniae 6701F which was susceptible to colistin (MIC 0.25μg/mL). The mcr-1 carryng plasmids of the three isolates (3111F, 3431F and 5798F) were successfully transferred to E. coli by conjugation and analyses of the WGS of these isolates indicated that the mcr-1 gene was located in an IncX4-type plasmid. E. coli 3431F belonged to ST744, E. coli 5798F to ST457 and K. pneumoniae 3111F to ST437. The Rapid Polymyxin NP test presented high sensitivity (98%) and specificity (98%) when compared with the reference method (BMD), furthermore, for 88.7% of the isolates the results were obtained within 2 hours. The Policimbac® and Superpolymyxins® agar presented high sensitivity (98% and 94.1%, respectively) but lower specificity (77% for the Policimbac® and 75.4% for Superpolymyxins® agar). The modifications (CBM, MPT and CSTT) of the CBDE test presented a good sensitivity (95.35%, 88.37% and 93.02%, respectively) and specificity (84%, 80% and 88%, respectively) for Enterobacterales, however the Very Major Errors (VME – 4.65% to CBM; 11.63% to MPT and 6.98% to CSTT) and Major Errors (ME - 16% to CBM; 20% to MPT and 12% to CSTT) were less satisfactory. None of the CBDE modifications were considered acceptable for non-fermenting isolates although only a reduced number of isolates was tested. This study showed that the prevalence of mcr-1 gene is very low among enterobacterial isolates with reduced susceptibility to carbapenems. Moreover, it was possible to establish that the plasmids harbouring the mcr-1 gene belong to the plasmid incompatibility group IncX4, indicating a high affinity between this plasmid and the mcr-1 gene in the Brazil. The fact that the K. pneumoniae mcr-1 isolate belonged to the ST437, which is considered a high risk clone associated with blaKPC gene in Brazil is of great concern. The test with best performance to be used as screening to detect of resistance to polymyxins was the Rapid Polymyxin NP test, which also is a much faster technique in comparison to the reference method
