Transcrição em microplasmas : predição de terminadores

Abstract

Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, uma enfermidade de distribuição mundial, responsável por consideráveis perdas econômicas. Este microrganismo possui um genoma reduzido com alto conteúdo de A+T e ausência de parede celular. Para investigar a patogênese de M. hyopneumoniae é importante entender seus mecanismos genéticos, porém, apesar do sequenciamento do genoma de várias linhagens (J, 7448, 7422, 232, 168 e 168-L), pouco se sabe sobre os mecanismos que regulam e controlam a expressão gênica neste microrganismo. Em M. hyopneumoniae 7448 foi previamente demonstrada a presença de sequências promotoras da transcrição no início de unidades transcricionais (UTs) e genes monocistrônicos (mCs). No entanto, o mecanismo de término da transcrição continua pouco conhecido em micoplasmas, vindo a ser o objeto de estudo neste trabalho. Para isto, foram utilizados três programas computacionais, ARNold, TransTermHP e WebGesTer, para predição de terminadores intrínsecos no genoma de M. hyopneumoniae 7448. Para a confirmação, os terminadores preditos foram classificados em classes de acordo com suas características estruturais e funcionais. Por meio das análises in silico, pôde ser confirmada a presença de terminadores em 63% dos 33 mCs e em 64% das UTs. As características padrão determinadas para os terminadores intrínsecos de M. hyopneumoniae 7448 foram: localização a uma distância entre -11 a 200 pb do códon de parada da tradução do gene alvo e possuir um valor de energia livre de Gibbs menor que -4 kcal/mol. Já a cauda poli-U não foi encontrada em nenhum dos terminadores confirmados. As análises de RT-PCR e qRT-PCR, demonstraram que os terminadores classes tc2, tc3 e tc4 possuem atividade funcional em micoplasmas. Estes resultados mostram que, apesar de divergirem do modelo de terminador de outras bactérias, como Escherichia coli, os terminadores de micoplasmas possuem atividade funcional. Assim, podemos sugerir que os terminadores intrínsecos sejam a principal forma de terminação da transcrição em M. hyopneumoniae 7448.Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of porcine enzootic pneumonia, a disease with global wide distribution and responsible for considerable economic losses.. This microorganism present a reduced genome with high A+T content and no cell wall. In order to investigate the pathogenesis of the M. hyopneumoniae it is important to understand its genetic mechanisms. Although the genome sequences of several lineages (J, 7448, 7422, 232, 168 e 168-L) have been described, the mechanisms that regulate and control gene expression in this organism are not fully understood. It has been previously demonstrated that the sequences that promote the transcription in M. hyopneumoniae 7448 are located at the 5’ end of the transcriptional units (UT) and monocistronic genes (mC). However, the termination mechanism of the transcription is still poorly understood in mycoplasmas such as M. hyopneumoniae 7448, justifying the chosen object of this study. In this work, three softwares were used to predict the intrinsic terminators in the M. hyopneumoniae 7448 genome: ARNold, TransTermHP, and WebGesTer. For confirmation, the predicted terminators were classified according to its functional and structural characteristics. Through in silico analysis it was possible to confirm the presence of terminators in 63% of the 33 mCs, and in 64% of the UTs. The characteristic patterns determined for the intrinsic terminators were localization between -11 and 200 bp distant from stop codon of the target gene and with a Gibbs free energy value of less than -4 kcal/mol. However, the poly(U) tail was not found in any confirmed terminator. The analysis by RT-PCR and qRT-PCR demonstrated that the terminators of class tc2, tc3 and tc4 are functionally active in M. hyopneumoniae. The results show that although diverging from the terminator model of other bacterial species, such as Escherichia coli, the terminators of mycoplasmas do have functional activity. Therefore, it is possible to suggest that the intrinsic terminators are the main form of transcription termination in M. hyopneumoniae 7448