Cancela Sehabiague, Martín Pablo

Marmontel, Pedro Quartiero

Portuguese

Lume 5.8

Evento Salão UFRGS 2018: FEIRA DE INOVAÇÃO TECNOLÓGICA DAUFRGS - FINOVAAno 2018Local Campus do Vale - UFRGSTítulo Estudo dos mecanismos de indução de apoptose emEchinococcus spp. e sua relevância para a identificação denovos alvos para o controle parasitárioAutores PEDRO QUARTIERO MARMONTELMARTIN PABLO CANCELA SEHABIAGUEOrientador HENRIQUE BUNSELMEYER FERREIRARESUMO TÍTULO DO PROJETO Estudo dos mecanismos de indução de apoptose em Echinococcus spp. e suarelevância para a identificação de novos alvos para o controle parasitário Orientador: Henrique Bulsemeyer FerreiraAluno: Pedro Quartiero Marmontel1. Introdução:A equinococose  (hidatidose)  cística  é  uma  doença  parasitária  causada  pela  fase  larval  deparasitos  cestódeos  pertencentes  ao  complexo  Echinococcus  granulosus senso  lato  (s.l.)  (AlvarezRojas,  Romig  &  Lightowlers,  2014) com  aspecto  crônico,  frequentemente  causa  morbidade  emortalidade  nos  seres  humanos.  Esta  doença  é  endêmica  no  Cone Sul,  com 200.000 novos  casosdiagnosticados por ano (WHO, 2012).A doença é causada pela forma larval do parasito (metacestódeo ou cisto hidático) e seu ciclo devida necessita de dois hospedeiros (Hemphill et al. 2009), um canídeo, como hospedeiro definitivo, eum ungulado doméstico (tipicamente um ovino ou um bovino) ou um primata, incluindo o homem,como hospedeiro intermediário.Na região rural,  é comum o reaproveitamento das  vísceras  do animal  abatido,  usado comoalimento de animais domésticos. Com isto, os protoescólices (PEs, formas pré-adultas), presentes nocisto hidático das vísceras do animal, são consumidos e se diferenciam em verme adulto no intestino docão. Uma vez no intestino, o verme deposita ovos que são liberados com as fezes, podendo haver aingestão acidental  destes ovos pelos seres humanos.  Uma vez no corpo, os ovos eclodem no tratodigestivo, liberando uma oncosfera que penetra no epitélio intestinal, seguindo principalmente para ofígado e pulmões. Nestes órgãos se desenvolve o cisto hidático, e o ciclo se completa.A doença pode permanecer assintomática durante décadas (Eckert & Deplazes, 2004) e, quandoos sintomas aparecem, o tratamento de escolha geralmente é o cirúrgico (Garcia, Morod & Schantizd,2007) sendo necessário o estudo de novos fármacos para o controle e tratamento da hidatidose. Com osequenciamento do genoma de três espécies do complexo E. granulosus s.l.: Echinococcus granulosuss.s. (genótipos G1),  Echinococcus ortleppi (genótipo G5) e  Echinococcus canadensis (genótipo G7)(Tsai  et  al.  2013,  Zheng  et  al.  2013  e  Maldonado  et  al.,  2016),  foram propostos  possíveis  alvosfarmacológicos (Tsai et al., 2013), como cistatinas, quinases e enzimas envolvidas no metabolismo denucleotídeos,  como  a  enzima  ribonucleotídeo-redutase  (RNR).  Contudo,  estudos  experimentais  devalidação destas enzimas como alvos terapêuticos ainda não foram realizados. Este projeto tem comoobjetivo avaliar os efeitos de potenciais drogas sobre Echinococcus spp. e a atividade da RNR. A RNR de Echinococcus spp. possui duas subunidades, uma maior (RNR1, 92,5 kDa) e umamenor  (RNR2,  38,5  kDa).  Em  Echinococcus spp.,  assim  como  em outros  organismos,  a  RNR éessencial para a síntese de nucleotídeos. Sabe-se já que a hidroxi-ureia (HU) age como um inibidor daRNR, reduzindo a subunidade RNR2 e tornando a enzima não funcional. Outro possível inibidor daRNR é o COH29, que se liga à subunidade RNR1, impedindo-a de se ligar a RNR2 para formação dotetrâmero (RNR1)2(RNR2)2.O projeto tem como objetivo elucidar a seletividade e o mecanismo de ação destes inibidores,através de ensaios enzimáticos e técnicas de biologia molecular. Os estudos que estão sendo realizadospretendem averiguar os mecanismos de ação destas drogas sobre Echinococcus spp. Com isso, espera-se contribuir para o desenvolvimento de novos fármacos e estratégias terapêuticas para equinococoses,e outras parasitoses.2. Atividades realizadas pelo bolsista:a) Coleta e processamento de cistos hidáticos e PEs de  E. granulosus s.s.  e  E. ortleppi.  Foramcoletados e processados cistos hidáticos de E. granulosus s.s. e E. ortleppi, provenientes de frigoríficona região metropolitana de Porto Alegre. Dos cistos, foram obtidas amostras de PEs. Após a coleta, osPEs foram lavados com PBS e corados com Azul de Tripan, a viabilidade foi avaliada por microscopiaóptica. Os PEs viáveis foram armazenados a 4 ºC até a sua utilização. Para determinação dos genótipose  espécies,  foi  feita  amplificação  por  PCR do  gene  da  enzima  citocromo-c-oxidase  1  (COX1)  eclivagem com a enzima de restrição AluI.b) Ensaios  in vitro utilizando os inibidores da RNR em protoescólices de E. granulosus s.s. e E.ortleppi. Foram realizados ensaios in vitro para avaliar a suscetibilidade dos PEs das duas espécies aconcentrações  crescentes  dos  inibidores  HU  e  COH29.  Em  cada  ensaio,  foram  usadosaproximadamente 500 PEs em 500 L  de meio RPMI com o inibidor HU  nas concentrações 5 mM, 10mM e 50 mM por 24 h. O mesmo tipo de ensaio foi feito com o inibidor COH29, nas concentrações de0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM. Posteriormente ao tratamento, a morfologia e a viabilidade dos PEs foramavaliadas. c) Análises proteômicas de protoescólices incubados com o inibidor da RNR Hidróxi-uréia. Apóstratamento  com HU  (50  mM)  extratos  proteicos  de  protoescólices  foram preparados  para  análiseproteômica.  As amostras obtidas serão posteriormente analisadas por espectrometria de massas (LC-MS/MS), para identificação e quantificação de proteínas.d) Expressão e purificação da subunidade RNR2 da RNR de E. granulosus s.s.  A partir de cloneplasmidial  recombinante  previamente  construído  pelo  nosso  grupo  de  pesquisa,  foi  realizada  aexpressão da subunidade menor (RNR2) em fusão com glutationa-S-transferase (GST) na linhagem deEscherichia coli BL21 pLysE. A proteína recombinante (EgRNR2-GST) foi purificada em coluna deafinidade Glutationa Sepharose 4B e a porção corresponde à GST foi removida por clivagem com aprotease TEV. A quantidade e a pureza da EgRNR2 recombinante produzida foi avaliada por SDS-PAGE 12%.3. Objetivos atingidos:a) Genotipagem de PEs coletados de 10 cistos hidáticos para determinação das espécies Echinococcuss.s. de E. ortleppi. b) Determinação da viabilidade dos PEs coletados para seleção de amostras com viabilidade superior a90%.c) Avaliação dos efeitos de concentrações crescentes dos inibidores da RNR, HU e COH29 sobre amorfologia e a viabilidade dos PEs.d) Preparação de extratos proteicos de PEs tratados ou não com os inibidores HU e COH29, paraposterior análise proteômica.e) Expressão da subunidade RNR2 recombinante de E. granulosus (Eg-RNR2) em E. coli.f) Purificação da proteína recombinante EgRNR2.Também foi adquirida experiência em técnicas de biologia molecular, como a eletroforese epurificação de proteínas por cromatografia de afinidade assim como estudada as bases teóricas doprojeto de pesquisa e atividades previamente realizadas pelo grupo.4. Resultados obtidos: a) Foi observada a redução da viabilidade dos PEs na presença dos dois inibidores da RNR (HU eCOH29) de E. granulosus (s.s), em meio RPMI com a presença de HU na concentração de 50mM e nomeio com 1mM de C0H29, após 24 h.b) Foram preparados extratos de PEs controle (não tratados) e tratados com 50 mM de HU para posterior identificação e quantificação de proteínas por LC-MS/MS.c) Foram otimizadas as condições (temperatura, tempo de indução e concentração de indutor) para aotimização  da  expressão  da  EgRNR2  recombinante  em  E.  coli  BL21  pLysE.d)  A EgRNR2  foipurificada com alto rendimento (10 mg/L de cultura).5. Conclusão:As atividades realizadas no primeiro período tiveram papel importante para o treinamento eaquisição  de  proficiência  nas  principais  técnicas  envolvidas  no  projeto  de  desenvolvimentotecnológico.  Foi  adquirida  experiência  em  técnicas  de  biologia  molecular,  como  a  eletroforese  epurificação  de  proteínas  por  cromatografia  de  afinidade,  e  em  técnicas  de  coleta  e  cultivo  deprotoescólices de E. granulosus.Como atividades do segundo período, serão realizadas análises por LC-MS MS das amostras deextratos de PEs tratados ou não com HU e COH29, para identificação e quantificação de proteínas. Aanálise comparativa dos resultados de LC-MS/MS deverá fornecer subsídios para a elucidação dosmecanismos de ação da HU e do COH29 sobre PEs de E. granulosus.Serão ainda otimizadas as condições de expressão da EgRNR1 em  E. coli e purificação daproteína recombinante. Juntamente a EgRNR2 recombinante, já purificada, será reconstituída in vitro aRNR  recombinante  na  sua  configuração  tetramérica  funcional  (RNR1)2(RNR2)2,  possibilitando  arealização de ensaios enzimáticos in vitro. Com isso, poderá ser verificada in vitro a possível ação daHU, da COH29 e de outras potenciais drogas inibidoras sobre a RNR de E. granulosus.Elucidado o mecanismo de ação destas drogas inibidoras, temos como perspectiva a elaboraçãode vacinas eficientes para equinococose cística e outras helmintíases. Além de ter grandes benefíciospara  a  indústria  pecuária,  diminuindo  consideravelmente  os  gastos  econômicos  anuais  com  otratamento do rebanho,  estes  novos fármacos propostos  têm potencial  de aumentar  a  eficiência  dotratamento da doença, que geralmente depende de cirurgias bastante invasivas.BIBLIOGRAFIAGarcia,  H.  H.,  Morod,  P.  L.,  Schantzd,  M.  P.  (2007).  Zoonotic  helminth  infections  of  humans:  echinococcosis,  cysticercosis  andfascioliasis. Current Opinion in Infectious Diseases. 20:489–494. Hemphill,  A.,  Stadelmann,  B.,  Scholl,  S.,  Muller,  J.,  Spiliotis,  M.,  Muller,  N.,  Gottstein,  B.  &SilesLucas,  M.  (2009).  Echinococcusmetacestodes as laboratory models for the screening of drugs against cestodes and trematodes. Parasitology: 1-19. Eckert, J. & Deplazes, P. (2004). Biological, epidemiological, and clinical aspects of echinococcosis, a zoonosis of increasing concern.Clin. Microbiol. Rev.17,107–135.5-Zhou, B., Su, L., Hu, S., Hu, W., Yip, M. L. R., Wu, J., Yen, Y. (2013). A small-molecule blocking ribonucleotide reductase holoenzymeformation inhibits cancer cell growth and overcomes drug resistance. CancerResearch, 73(21),1094-1099. Zheng, H., Zhang, W., Zhang, L., Zhang, Z., Li, J., Lu, G., Zhu, Y., Wang, Y., Huang, Y., Liu, J., Kang, H., Chen, J., Wang, L., Chen, A.,Yu, S., Gao, Z., Jin, L., Gu, W., Wang, Z., Zhao, L., Shi, B., Wen, H., Lin, R., Jones, M. K., Brejova, B., Vinar, T., Zhao, G., McManus, D.P., Chen, Z., Zhou, Y., Wang, S. (2013). The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus. Nat Genet 4510: 1168-1175.Maldonado, L., Assis, J.,  Araujo M. F., Salim C. A., Machiarolli,  N., Cucher, N., Camicia, F.,  Fox, A., Rosenzvit,  M., Oliveira, G.,Kamenetzky,  L.  (2016).  The  Echinococcus  canadensis  (G7)  genome:  a  key knowledge  of  parasitic  platyhelminth  human  diseases.IMPaM, CONICET, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires. BMC Genomics 18:204.Alvarez Rojas  CA,  Romig T,  Lightowlers  MW (2014) Echinococcus granulosus sensu lato genotypes infecting humans—review ofcurrent knowledge. Int J Parasitol 44: 9–18. WHO (2012). World Health Organization. Accelerating work to overcome the global impact of neglected tropical diseases – A roadmapfor implementation, avaiable from http://www.who.int/neglected_diseases/NTD_RoadMap_2012_Fullversion.pdf.

Estudo dos mecanismos de indução de apoptose em Echinococcus spp. e sua relevância para a identificação de novos alvos para o controle parasitário

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