Souza, Heryk Motta de

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Lume 5.8

Evento Salão UFRGS 2017: SIC - XXIX SALÃO DE INICIAÇÃOCIENTÍFICA DA UFRGSAno 2017Local Campus do ValeTítulo Identificação e caracterização funcional de genes envolvidosna virulência de Cryptococcus gattiiAutor HERYK MOTTA DE SOUZAOrientador LIVIA KMETZSCH ROSA E SILVAIdentificação e caracterização funcional de genes envolvidos na virulência de Cryptococcus gattii. Heryk Motta de Souza*, Lívia Kmetzsch. Centro de Biotecnologia – UFRGS  Criptococose é uma infecção fúngica de alta importância clínica frequentemente manifestada como pneumonia, podendo estar associada à meningoencefalite e levar o paciente ao óbito. Dentre os agentes etiológicos causadores desta doença, a levedura Cryptococcus gattii possui maior incidência de infecção em pacientes imunocompetentes, quando comparada à Cryptococcus neoformans. Acreditava-se que a distribuição geográfica de C. gattii era limitada às regiões tropicais e subtropicais, porém, na última década, diferentes linhagens de C. gattii foram isoladas em regiões de clima temperado, incluindo países da Europa e América. O sucesso da infecção por essa levedura  é devido à produção de inúmeros fatores de virulência como, por exemplo, a síntese de uma cápsula polissacarídica, capacidade de formar biofilme, síntese de melanina e crescimento a 37 ºC. Heat Shock Proteins (Hsp) já foram descritas por atuarem de forma a influenciar esses fatores de virulência. Em Candida albicans, constatou-se a influência das Hsps na formação de biofilme e resistência à drogas antifúngicas. Em C. neoformans, Hsps atuam diretamente na virulência devido o aumento de expressão de diferentes proteínas dessa classe (Hsp12, Hsp60, Hsp70 e Hsp90) em modelo murino de criptococose e também na sinalização celular em resposta a diferentes estresses.  Considerando o exposto, este trabalho tem por objetivo selecionar e caracterizar funcionalmente um gene potencialmente importante para a fisiologia celular e virulência de C. gattii. Para tal, foram analisados  dados prévios de RNAseq obtido de lavado broncoalveolar de camundongos da linhagem BALB/c infectados por C. gattii linhagem R265. Os genes mais expressos foram analisados a partir do cálculo de FPKM e dois candidatos foram selecionados, sendo estes os genes CNBG_2441 e CNBG_5006. O gene CNBG_2441 codifica putativamente uma pequena Hsp (small Hsp), enquanto CNBG_5006  uma proteína de sinalização relacionada a situações de estresse. Com a finalidade de selecionar o gene alvo deste estudo, foi feita a avaliação da expressão relativa dos mesmos nas condições de choque térmico, interação com macrófagos J774A.1 e exposição à concentração sub-inibitória de fluconazol. CNBG_2441 apresentou aumento de expressão em condição de interação com macrófagos, redução em concentração sub-inibitória de fluconazol e aumento significativo em condição de choque térmico. CNBG_5006 apresentou resultados semelhantes, porém com diminuição de expressão em condição de interação com macrófagos. Considerando a divergência nos resultados de expressão do genes avaliados em interação com macrófagos, o gene   CNBG_2441 foi selecionado para análise funcional a partir da construção de um mutante nulo para o mesmo. Para construção do vetor de deleção, as regiões 5’ e 3’ do gene alvo foram aplificadas por PCR e  clonadas no vetor pDONR_NAT com marca de resistência a nourseotricina. A construção do vetor foi confirmada  por padrão de clivagem com enzimas de restrição.  Como perspectivas deste trabalho, tem-se a construção do mutante nulo seguida da construção de uma linhagem complementada para  caracterização funcional do gene CNBG_2441 na virulência de C. gattii R265.  

Identificação e caracterização funcional de genes envolvidos na virulência de Cryptococcus gattii

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