Paiva, Rodrigo Minuto

Paris, Fernanda de

Rocha, Júlia Souza da

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Lume 5.8

35ª SEMANA CIENTÍFICA DO HOSPITAL DE CLÍNICAS DE PORTO  46 Clin Biomed Res 2015; 35 (Supl.)   P 4359 Determinação do limite mínimo de detecção da técnica de pcr em tempo real para o complexo Mycobacterium Tuberculosis Júlia Souza da Rocha, Fernanda de Paris, Rodrigo Minuto Paiva Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA)  Introdução: As bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis têm crescimento lento e alto poder infectocontagioso. Causam principalmente tuberculose pulmonar, mas podem ser responsáveis por meningites e infecções em outros sistemas, que são mais comumente identificadas  em pacientes imunocomprometidos. O desenvolvimento de métodos rápidos, sensíveis e específicos no diagnóstico destas bactérias tem grande importância no auxílio ao controle da doença. O uso de reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) permite a identificação do DNA do bacilo com alta sensibilidade e especificidade. A menor quantidade de analito que pode ser detectada em um procedimento, dentro de um limite de confiança, é o limite mínimo de detecção (LMD) de uma  técnica. Quando  os  limites  de  confiança   são  estabelecidos, a  probabilidade  de  erros  falso-positivo  e  falso-negativo  é considerada aceitável.  Este trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia Molecular do Hospital de Clínicas de Porto Alegre com o objetivo de determinar o limite de detecção para a técnica de qPCR para o complexo M. tuberculosis, complementando a validação do ensaio. Métodos: Foram feitas diluições de 1 e 10 cópias/µL de DNA bacteriano a partir do controle comercial quantificado 1,08 X104 cópias/µL (Vircell®, Granada, Espanha). As diluições foram submetidas a 20 ensaios de amplificação por qPCR (Kit Platinum qPCR SuperMix-UDG, Invitrogen™), utilizando fragmentos de DNA marcados com fluorescência específicos para a hibridização na região de interesse, as sondas (TaqMan®). Resultados: Dos 20 ensaios realizados, 19 apresentaram resultado positivo, ou seja, amplificação do alvo. O limite mínimo de detecção encontrado foi de 10 cópias/µL em 95% das replicatas, sendo que o menor CT de amplificação foi 33,2 e o maior 41,9. Discussão: O ensaio demonstrou um aumento da sensibilidade analítica quando comparado ao limite de detecção do Nested-PCR utilizado anteriormente pelo laboratório (25 cópias/µL). O ensaio se tornou também mais específico, pois utiliza dois métodos de identificação – sonda e primer – da região alvo do DNA. Além disso, a determinação do CT de amplificação torna o teste menos subjetivo e, portanto, mais confiável. Palavras-chaves: Mycobacterium Tuberculosis, PCR em tempo real, limite mínimo de detecção.      

Determinação do limite mínimo de detecção da técnica de pcr em tempo real para o complexo Mycobacterium Tuberculosis

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Determinação do limite mínimo de detecção da técnica de pcr em tempo real para o complexo Mycobacterium Tuberculosis

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