Basso, Luiz Augusto

Fonseca, Isabel Osório da

Rizzi, Caroline

Santos, Diógenes Santiago

Weber, Patricia Grotkowski

Lume 5.8

 Ciências Biológicas  377 CLONAGEM, SEQÜENCIAMENTO E SUPEREXPRESSÃO DA ENZIMA DAHP SINTASE DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS H37RV. Patricia Grotkowski Weber, Caroline Rizzi, Isabel Osório da Fonseca, Luiz Augusto Basso, Diógenes Santiago Santos, Jeverson Frazzon (orient.) (Ciência dos Alimentos, ICTA, UFRGS). No início do século XXI, a tuberculose (TB) ressurgiu como um problema de saúde global, matando por ano mais de 1, 8 milhões de pessoas. Estima-se que em torno de um terço da população mundial é portadora do agente etiológico da doença, o Mycobacterium tuberculosis. O ressurgimento da TB está relacionado com a epidemia de AIDS e ao aparecimento de linhagens multi-resistentes as drogas comercializadas, o que determina a procura de novos agentes antimicrobacterianos. Um alvo de interesse para o desenvolvimento de novas drogas é a via do ácido chiquímico, que está presente em M. tuberculosis mas ausente em humanos. A via é composta por uma série de 7 enzimas que darão origem a um precursor aromático comum, o corismato, composto fundamental no metabolismo dos aminoácidos aromáticos essenciais para a sobrevivência do microrganismo. A primeira etapa nesta via é a reação catalizada pela 061 enzima DAHP sintase (3-Deoxi-D-arabino-heptulosonic acid 7-phosphate syntase; E. C. 4.2.1.15) codificada pelo gene aroG em M. tuberculosis. O gene amplificado por PCR, a partir do DNA genômico, acrescido dos sítios de restrição NdeI e BamHI foi ligado no vetor de clonagem pCR-Blunt. Posteriormente, o fragmento clonado foi clivado com as enzimas de restrição citadas e religado ao vetor de expressão pET-23a(+). O plasmídeo recombinante pET-23a(+)::aroG foi seqüenciado através do método de Sanger. Para a superexpressão, o plasmídeo foi transformado em células E. coli Rosetta-gami(DE3) por eletroporação e então crescidas por 24 horas sem adição de IPTG. A expressão das frações foram analisadas em gel de SDS-PAGE. O seqüenciamento demonstrou a identidade do gene e a ausência de mutações. A análise do gel de SDS-PAGE revelou a superexpressão da proteína de aproximadamente 50 kDa na fração solúvel. A razão deste trabalho é a existência de um enorme potencial tecnológico para o desenvolvimento de drogas anti tuberculose de baixo custo e com curto período de tratamento através da utilização da tecnologia do DNA recombinante. (CNPq-Proj. Integrado).  

Clonagem, seqüenciamento e superexpressão da enzima dahp sintase de mycobacterium tuberculosis H37RV

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