Oldiges, Daiane Patricia

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Lume 5.8

7/10/20101Produção da Cisteíno Endopeptidase Degradadora de Vitelina recombinante para uso em vacina anti-carrapatoOldiges DP1,4; Seixas A1; Parizi LF1; Lorenzini DM1; Da Silva Vaz Jr I1,3; Termignoni C.1,21 Centro de Biotecnologia - UFRGS; 2 Departamento de Bioquímica - UFRGS;  3 Faculdade de Veterinária - UFRGS;  4 Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto AlegreINTRODUÇÃO MATERIAIS E MÉTODOS RESULTADOSO carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um artrópode hematófago de grande importância econômica. Seu controle é feito através do uso deacaricidas químicos, que podem contaminar a carne e o leite. Tais problemas acentuam a busca por um método de controle alternativo, sendo o uso de vacinasbastante promissor. Para tanto, torna-se necessário a identificação de moléculas com potencial protetor, caracterização de seus papéis na fisiologia do carrapato eprodução destes antígenos na forma recombinante, etapa fundamental para a produção de uma vacina economicamente viável.A obtenção de aminoácidos necessários para o desenvolvimento do embrião do carrapato é feita através da degradação de vitelina (Vt). Até hoje foramdescritas 3 enzimas do carrapato R. microplus envolvidas na degradaçao de Vt em ovos BYC (Boophilus Yolk pro-Cathepsin) (Logullo et al, 2008) THAP (TickHeme-binding Aspartic Protease) (Sorgine et al, 2000) e VTDCE (Vitellin Degrading Cysteine Endopeptidase)(Seixas et al, 2003). A VTCDE está asssociada à Vt, eé a mais ativa dentre as três, reforçando a hipótese de que a VTDCE desempenha um papel importante no desenvolvimento do artópode (Seixas et al, 2006).A imunização de bovinos com a VTDCE nativa conferiu proteção parcial contra infestações pelo carrapato R. microplus. Em função da dificuldade de obtençãoda proteína a partir de carrapatos sua produção na forma recombinante impõem-se como alternativa de esoclha para otbê-la nas quantidades necessárias paraavançar com os estudos de imuniproteção.O presente trabalho tem por objetivo expressar, purificar e verificar a imunogenicidade da VTDCE recombinante (rVTDCE) em coelho e bovino.Obtenção da VTDCE nativa – A forma nativa da VTDCE foi obtida através deprocessos cromatográficos descritos previamente por Seixas et al (2003).Produção da VTDCE recombinanteSolubilização dos corpos de inclusão – A VTDCE recombinante é expressatanto na fraçao solúvel quanto na fraçao insolúvel do extrato bacteriano. Para asolubilizaçao dos corpos de inclusão foram testados dois agentesdesnaturantes: Cloridrato de Guanidina (6M) e Uréia (8M).Imunização – Coelho e bovinos foram imunizados com a VTDCE recombinante.O coelho foi imunizado com a banda da rVTDCE recortada de gel SDS-PAGE.Bovinos foram imunizados com a VTDCE purificada por cromatografia.Ensaios imunogênicos – Em western blot o soro de bovinos e coelhosimunizados com VTDCE e rVTDCE foi usado para reconhecer ambas asformas da proteína, e deste modo testar a reatividade cruzada entre eles.Ensaio de atividade – Para testar a atividade da enzima recombinante, aamostra purificada foi hidrolisada com trombina para remover a proteina defusão inserida pelo vetor de expressão ( Trx•Tag™ thioredoxin protein de 109aminoácidos). Para a realização dos ensaios fluorimétricos foi usado osubstrato N-carboxibenzoyl-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin (N-Cbz-Phe-Arg-MCA) em tampão citrato-fosfato pH 3,5 e ditiotreitol (DTT). Os inibidores E-64, Leupeptina, PMSF e Pepstatina A foram testados.1 82 43 7651 82 43 765A B50 kDa  25 kDa  rVTDCE 50 kDa 25 kDarVTDCEFigura 1 - Western blot da rVTDCE. A – Anticorpo anti-cauda de histidina. B – Soro de coelho anti-VTDCE nativa.Sobrenadante do extrato de bactérias após (1) 2 h, (2) 4 h, (3) 16 h de indução e (4) não induzido. Sedimento do extrato debactérias após (5) 2 h, (6) 4 h e (7) 16 h de indução e (8) não induzido.CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS- A solubilizaçao da rVTDCE com guanidina se mostrou mais eficiente econservou as propriedades antigênicas necessárias para testes de vacinação.- A proteina recombinante purificada mantém as características deantigenicidade e imunogenicidade, de forma a poder ser utilizada comoantígeno vacinal.- Os soros policlonais confirmaram a reatividade cruzada entre as proteínasrecombinante e nativa.- A proteína recombinante apresenta atividade sobre os substratos sintéticose é totalmente inibida por inibidores específicos.Os próximos passos a serem realizados são a alimentação de carrapatos comanticorpo anti-rVTDCE para verificar seu efeito no metabolismo desseartrópode.Apoio Financeiro:A BFigura 2 - SDS-PAGE (12%): Eluições da purificação em resina de Ni-imobilizado. MW marcador, (1) fração solúvel doextrato de bactérias, (2) fração não ligada à resina, 3 a 6 frações eluídas com 100 mM de imidazol, 7 a 8 frações eluídascom 500 mM imidazol.Figura 4 – Western blot de VTDCE e rVTDCE sondados com soros de animais imunizados com VTDCE erVTDCE. A) Proteína nativa (1) SDS-PAGE da VTDCE purificada; 2-5) western blot sondado com (2) sorode coelho imunizado com VTDCE (3) soro de coelho imunizado com rVTDCE, (4) soro de bovino imunizadocom VTDCE (5) soro de bovino imunizado com rVTDCE. B) Proteína recombinante: (1) SDS-PAGE darVTDCE purificada; 2-5) western blot sondado com (2) soro de coelho imunizado com VTDCE (3) soro decoelho imunizado com rVTDCE, (4) soro de bovino imunizado com VTDCE (5) soro de bovino imunizadocom rVTDCE . MW molecular weight.Figura 3 – SDS-PAGE (12%) e western blot mostrando a rVTDCE obtida pela solubilização dos corpos de inclusão. SDS-PAGE de A) (1) fração solubilizada com uréia 8M e B) ( 1) com guanidina 6M. C) Western blot: (1) fração solubilizada comguanidina 6M e (2) com 8M de uréia. MW molecular weight.Tabela 1 – Caracterização enzimática da rVTDCE: perfil de inibiçãoInibitor Concentração (mM) Inibição (%)E-64 0.01 100Leupeptina 0.01 100Pepstatina A 0.1 32.7PMSF 0.001 0A amostra foi incubada em tampão fosfato de sódio / citrato de sódio , pH 3.5 a 37 C, por 10 min, napresença ou ausência dos inibidores E-64, Leupeptina, PMSF e Pepstatina A, antes da adição do substratoN-cbz-Phe-Arg-MCA. A inibição total por E-64 e Leupeptina leva a conclusão de que a proteína em questãorealmente se trata de uma cisteíno endopeptidase.MW     1         2         3          4         5         6         7         8         9A B C 1            250-25-MW     1MW       150-50-25-25--rVTDCE-rVTDCE-rVTDCE-rVTDCE- rVTDCE- VTDCESub clonagem pET 32aA confirmação da expressão por Western Blot Preparação do extratoExpressão em E. colicepa BL21 Star (DE3)Crescimento a 37 C até DO 0,6Indução com IPTG 1mM2h a 37 CCauda de Histidina Fração solúvelEluição com 100 e 500mM ImidazolPurificação em coluna de afinidade ao Ni++Referencias:-LOGULLO, C.; VAZ, SORGINE, M. H.; PAIVA-SILVA, G. O.; FARIA, F. S.; ZINGALI, R. B.; DE LIMA, M. F.; ABREU, L.;  OLIVEIRA, E. F.; ALVES, E. W.; MASUDA, H.; GONZALES, J. C., MASUDA, A.; OLIVEIRA, P. L. Isolation of na aspartic proteinase precursor from the egg of the hard tick Boophilus microplus. Parasitology, 116: 525-532, 1998.-SORGINE, M. H., LOGULLO, C., ZINGALI, R. B., PAIVA-SILVA, G. O., JULIANO, L., OLIVEIRA, P. L. A heme-binding aspartic proteinase from the eggs of hard tick Boophilus microplus. The Journal of Biological Chemistry, 275: 28659-65, 2000.-SEIXAS, A.; DOS SANTOS, P. C.; VELLOSO, F. F.; DA SILVA VAZ, I. JR.; MASUDA, A.; HORN, F.; TERMIGNONI, C. A Boophilus microplus vitellin-degrading cysteine endopeptidase. Parasitology, 126: 155-163, 2003.

Produção da Cisteíno Endopeptidase Degradadora de Vitelina recombinante para uso em vacina anti-carrapato

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