鈴木 高史

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70305530神戸常盤大学26670197research repor

鈴木, 高史

SUZUKI, Takashi

Kobe Tokiwa University　Institutional　Repository

神戸常盤大学・保健科学部・教授科学研究費助成事業　　研究成果報告書様　式　Ｃ－１９、Ｆ－１９－１、Ｚ－１９ （共通）機関番号：研究種目：課題番号：研究課題名（和文）研究代表者研究課題名（英文）交付決定額（研究期間全体）：（直接経費）３４５３５挑戦的萌芽研究2017～2014遺伝子組み換えツェツェバエの創出―アフリカトリパノソーマ症制圧を目指してA novel approach for gene-manipulation of tsetse fly７０３０５５３０研究者番号：鈴木　高史（Suzuki, Takashi）研究期間：２６６７０１９７平成 年 月 日現在３０   ６ ２９円     2,700,000研究成果の概要（和文）：アフリカトリパノソーマ症を媒介するツェツェバエの新たなコントロール法の構築を行うことを目的として、以下の解析を行った。ツェツェバエのコロニーを確立し麻酔システムの検討を行った。さらにGlossina palpalis defensin（GpDef）分子の抗アフリカトリパノソーマ原虫活性プロファイルを明らかにした。当初予定していた、貯精嚢へのインジェクションは困難であったため、アフリカトリパノソーマ原虫の動き、エキソソーム関連分子解析、ツェツェバエゲノム上のポリドナウイルス類似配列を利用しての代替遺伝子組換えシステムの構築検討を行った。研究成果の概要（英文）：Tsetse flies (Glossina spp.) transmit African trypanosomiasis. In order to effectively control the disease, development of a novel gene manipulating method is expected, which generates the tsetse fly refractory to African trypanosomes. For that purpose, Glossina insectary was firstly set up and preliminary anesthetic system of Glossina was established. Then, anti-microorganism activity of Glossina palpalis defensin（GpDef）was analyzed. The results showed that the molecule possessed a specific anti-trypnosomal activity.Initial idea of injecting DNA molecules into G. palpalis spermatheca was not successful. Thus in order to see the feasibility of establishing future gene modification system, the following analyses were carried out: a motility and exosome-related molecule of African trypanosome was analyzed and Glossina genome was surveyed in detail for polydnavirus.研究分野：分子細胞生物学キーワード： ツェツェバエ　ディフェンシン　アフリカトリパノソーマ原虫  １版様 式 Ｃ－１９、Ｆ－１９－１、Ｚ－１９、ＣＫ－１９（共通） １． 研究開始当初の背景  アフリカトリパノソーマ症は人獣共通感染症であり、アフリカの人々の健康、タンパク源としての家畜に甚大な被害を与えている。本疾患はアフリカトリパノソーマ原虫により引き起こされ、媒介昆虫のツェツェバエにより伝播される。本疾患に対してのコントロールは、主に殺虫剤によるツェツェバエの駆除により行われているが、その効果は極めて限定的である。一方、マラリアや他の寄生虫疾患を媒介するハマダラカなどの媒介昆虫に対しては、ショウジョウバエの遺伝子組み換え技術が応用され、その卵に外来遺伝子を導入することにより、当該寄生虫疾患を伝播しない昆虫が作製され、新たな寄生虫疾患コントロールツールが得られてきている。しかし、遺伝子組み換えツェツェバエ作製の試みは国内外で行われてきているが、成功例は皆無である。この主要な原因は、ツェツェバエが卵を産まず、卵が母体内で孵化し、蛹化寸前の幼虫まで発育した状態で出てくる、胎生である（卵に外来遺伝子を導入できない）ことにある。  ２． 研究の目的   ツェツェバエの新規遺伝子組換えシステムの構築を検討し、さらにツェツェバエのエフェクター分子としての Glossina palpalis defensin（GpDef）分子の抗アフリカトリパノソーマ原虫活性を解析することにより、新たなアフリカトリパノソーマ症制圧につなげることを目的とした。  ３． 研究の方法   以下のような方法で解析を進めた。 （１）ツェツェバエのコロニー作製と効果的な麻酔システムの探索 （２）GpDef分子の抗微生物活性プロファイル解析 （３）代替方法の探索  ４． 研究成果  （１）ツェツェバエのコロニー作製と効果的な麻酔システムの探索  ツェツェバエGlossina palpalis種のコロニーを本研究用に確保し、メンブレンフィーディングにより吸血させるシステムを確立した。DNAのインジェクションを行うために氷上5分の麻酔では不十分であることが判明した。そこで、まずは十分な数が確保できるハマダラカ Anopheles gambiaeを用いてDrosophila で 麻 酔 に 用 い ら れ るtriethylamine (FlyNap (Carolina Biological Supply))を用いて、その有効性を解析した。その結果、ハマダラカの羽化後の日齢が FlyNapによる麻酔効果に重要なことが明らかになった。羽化3日後のハマダラカは羽化5日後のものに比べて麻酔効果が表れるまでより時間がかかるが、短い時間で麻酔がきれる傾向があることが明らかになった（表１、表２）。 Concentration of FLyNap  First revival R (%) after  30 min R (%) after  60 min R (%) after  90 min R (%) after  120 min 1 µl of stock 60min 0  10 80 90 2 µl of stock 85min 0 0 10 80 1/10 of stock 25min 10 40 100 100 1/100 of stock No KD No KD No KD No KD No KD 1/1000 of stock No KD No KD No KD No KD No KD control (10µl of ethanol) No KD No KD No KD No KD No KD 表1. FlyNapによる羽化3日後のAn. gambiaeに対する麻酔効果  各郡10匹ずつ3回の平均結果。First revival time:最初の An. gambiaeが麻酔から覚めるまでに要した時間。No KD: 麻酔にかからなかった群。  Concentration of FLyNap  First revival R (%) after  30 min R (%) after  60 min R (%) after  90 min R (%) after  120 min 1 µl of stock 9min 14sec 40  40 40 40 2 µl of stock 1h 16sec 0 0 0 10 1/10 of stock 2min 30sec 60 100 100 100 1/100 of stock 9min 53sec 10 10 10 10 1/1000 of stock No KD No KD No KD No KD No KD control (10µl of ethanol) No KD No KD No KD No KD No KD 表2. FlyNapによる羽化5日後のAn. gambiaeに対する麻酔効果  各郡10匹ずつ3回の平均結果。First revival time:最初の An. gambiaeが麻酔から覚めるまでに要した時間。No KD: 麻酔にかからなかった群。  上記、An. gambiaeの結果に基づき、FlyNap 5 µlを用いることで、同様にG. palpalisに対しても麻酔をかけることができる予備的な解析データが得られた。しかし、FlyNapを用いるにはAn. gambiaeの結果から、羽化後の日数が重要なファクターとなると推察されたが、解析に必要な十分量の G. palpalisを得られなかった。 その後、所属異動に伴い、ツェツェバエのインセクタリーへの頻繁なアクセスが困難になり、また日本国内においてツェツェバエを輸入して解析することが困難であった。このため、実際のインジェクションまで進めることができなかった。  （２）GpDef分子の抗微生物活性プロファイル解析  アフリカトリパノソーマ症の制圧を目標として、遺伝子組換えを目指すうえで、抗アフリカトリパノソーマ原虫活性を有するエフェクター分子の同定が重要となる。そこでツェツェバエの抗菌ペプチド defensin分子（GpDef）に着目しマラリア原虫、アフリカトリパノソーマ原虫、大腸菌、黄色ブドウ球菌に対してのエフェクター作用の解析を以下のように行った。 Ⅰ. GpDefをハマダラカの中腸で発現させて、マラリア原虫を感染させることにより、抗マラリア原虫活性プロファイルを解析した。 Ⅱ. GpDefペプチドを合成し、in vitro 培養アフリカトリパノソーマ原虫（ツェツェバエ感染型）, in vitro 培養大腸菌・黄色ブドウ球菌に対する増殖抑制活性測定を行った。  Ⅰ. DsRed-GpDef融合タンパク質発現ハマダラカ作製とその抗マラリア原虫活性解析   ハマダラカ（Anopheles stephensi）の728胚にpBac-pvitellogenin-DsRed-GpDef（図1）のインジェクションを行い、EGFP蛍光でスクリーニングを行い、2系統を得た。このうち、発現が安定している1系統を用いて、以下の解析を行った。   DsRed-GpDef発現蚊（TG）とコントロール蚊（WT）を吸血させ、48時間後にDsRedシグナルを TG蚊で確認した（図 2）。またリアルタイム PCRにより、DsRed-GpDef発現蚊で吸血に伴いGpDef分子が発現することを確認した。   DsRed-GpDef発現蚊（TG）とコントロール蚊（WT）にマラリア原虫を感染させ、oocystと sporozoiteの数を比較した。その結果、oocyst数では減少が見られたが、sporozoite数では有意な差が見られなかった（表3）。  表3. WTとTGでのsporozoite数の比較 n = 15, spz: sporozoite; SG: salivary gland   Ⅱ. GpDefペプチドの培養系での抗アフリカトリパノソーマ原虫活性、抗菌活性解析  GpDefペプチドは（推定マチュア部位、推定活性部位いずれも）培養アフリカトリパノソーマ原虫（ツェツェバエ感染型）に対して、500μM以上の濃度で増殖を抑制した。  大腸菌、黄色ブドウ球菌に対しては、 推定マチュア分子、推定活性部位いずれも 2mMでも増殖阻害はかからなかった。   ツェツェバエの体内にはWolbachiaのような共生細菌が存在していることが知られている。このため、GpDefが大腸菌や黄色ブドウ球菌などのバクテリアに対して抗菌スペクトルを示さなかったものと考えられる。またマラリア原虫の oocyst数では減少が見られたが sporozoite数の減少が見られなかったことから、マラリア原虫に対しては大きな増殖阻害効果は無く、GpDefはアフリカトリパノソーマ原虫特異的に増殖を抑制すると推定された。このことからGpDef分子は抗アフリカトリパノソーマ原虫活性を有するエフェクター分子として、将来的な遺伝子組換え（発現量を増やすなど）によりアフリカトリパノソーマ症制圧を目指す際に有効であると考えられた。  （３）代替方法の探索  当初の計画どおりの進展が難しかったため、代替手段でツェツェバエの遺伝子組換えを行うシステムの検討を行った。  まずは寄生生物であるアフリカトリパノソーマ原虫自体を遺伝子導入ツールに用いることができないか検討を試みた。アフリカトリパノソーマ原虫を遺伝子導入に用いるには、動きを制御する必要があると考えられた。この観点から動き関連分子 TbUNC119BP（Tb927.7.5300）の一部分の強制発現で原虫細胞の動きを制御することができること、またアフリカトリパノソーマ原虫のエクソソ図 1. pBac-pvitellogenin-DsRed-GpDefの模式図 GpDefを DsRed monomerと融合した形でAn gambiaeのvitellogenin promotorの制御下で発現するように構築した。 図 2. pBac-pvitellogenin-DsRed-GpDef導入An. stephensiの蛍光顕微鏡観察  吸血 2日後の WT（非組換え蚊）と TG（遺伝子組換え蚊）の蛍光画像。TGでは腹部でDsRedの発現が観察された。 ームに含まれる分子群と相互作用することを明らかにした。従って、TbUNC119BPを制御して、エクソソーム中に組換えを行いたい遺伝子を導入できれば、ツェツェバエの遺伝子組換えシステムの構築につながると考えられた。  ポリドナウイルスは,寄生バチのゲノムにコードされている。ウイルス粒子の複製は雌バチの卵巣と側輸卵管の間に位置するカリックス部細胞内でのみ進行し、その後ウイルス粒子は寄生の際に卵と共に宿主に注入される。ツェツェバエゲノムにポリドナウイルス配列相同の部位があることは報告されてい た (International Glossina Genome Initiative, Science 344 380-386(2014))。しかし、その機能は不明のままである。Vectorbaseの配列情報をもとに、ポリドナウイルス類似配列を検索したところ、パッケージングに必要な ATPase, protease, capsidなどがそろっており（表４）、ツェツェバエ内でもウイルス粒子として機能している可能性が考えられた。ポリドナウイルスの寄生バチ以外のゲノム上での機能は抗ウイルス作用などが報告されている（Gasmi et al. PloS Genetics (2015)）が、ウイルス粒子としてではない。このため、ウイルス粒子として働いている場合、そのシステムを利用しての遺伝子組換えの方法が構築できる可能性が考えられた。  表4. Glossinaゲノム上のポリドナウイルス類似配列  カラーでハイライトしたものは近接している配列    本研究ではツェツェバエを解析対象として、麻酔システムの検討、抗アフリカトリパノソーマ活性を有するエフェクター分子としてのGpDef分子のプロファイル解析を行った。当初予定していた、貯精嚢へのインジェクションは困難であったため、アフリカトリパノソーマ原虫の動き関連分子解析、ポリドナウイルス様配列の解析を行った。今後、これらの解析を引き続けて進めることにより、遺伝子組換えツェツェバエの創出につなげていきたい。   ５．主な発表論文等 （研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）  〔雑誌論文〕（計 11件） 1. The Role of Detoxification Enzymes in the Adaptation of the Major Malaria Vector Anopheles gambiae (Giles; Diptera: Culicidae) to Polluted Water. King SA, Onayifeke B, Akorli J, Sibomana I, Chabi J, Manful-Gwira T, Dadzie S, Suzuki T, Wilson MD, Boakye DA, de Souza DK. Journal of medical entomology 54(6) 1674-1683 (2017).  doi: 10.1093/jme/tjx164 査読有   2. Indication of Risk of Mother-to-Child Toxoplasma gondii Transmission in the Greater Accra Region of Ghana. Kwofie KD, Ghansah A, Osei JH, Frempong KK, Obed S, Frimpong EH, Boakye DA, Suzuki T, Ohta N, Ayi I. Maternal and child health journal 20(12) 2581-2588 (2016). doi: 10.1007/s10995-016-2084-z 査読有  3. Risk of transmission of viral haemorrhagic fevers and the insecticide susceptibilitystatus of Aedes aegypti (linnaeus) in some sites in Accra, Ghana. Suzuki T, Osei JH, Sasaki A, Adimazoya M, Appawu M, Boakye D, Ohta N, Dadzie S. Ghana medical journal 50(3) 136-141 (2016). PMC5044787 査読有  4. Clonal types of Toxoplasma gondii among immune compromised and immune competent individuals in Accra, Ghana. Ayi I, Kwofie KD, Blay EA, Osei JH, Frempong KK, Koku R, Ghansah A, Lartey M, Suzuki T, Boakye DA, Koram KA, Ohta N. Parasitology international 65(3) 238-244 (2016). doi: 10.1016/j.parint.2016.01.004 査読有  5. Discovery of Point Mutations in the Voltage-Gated Sodium Channel from African Aedes aegypti Populations: Potential Phylogenetic Reasons for Gene Introgression. Kawada H, Higa Y, Futami K, Muranami Y, Kawashima E, Osei JH, Sakyi KY, Dadzie S, de Souza DK, Appawu M, Ohta N, Suzuki T, Minakawa N. PLoS neglected tropical diseases 10(6) e0004780 (2016). doi: 10.1371/journal.pntd.0004780 査読有  6. Effectiveness of SP-IPTp for Malaria and Evidence for the Need of T. gondii Infection Preventive Policy during Pregnancy in Ghana. Arthur-Mensah RJ, Blay AE, Ayi I, Larbi J, Suzuki T, Ohta N. Journal of Infectious Diseases and Epidemiology 2(3) 1-8 (2016). doi: 10.23937/2474-3658/1510018 査読有   7. Evaluating triethyamine in the anaesthesia of Anopheles gambiae. de Souza DK, Shafiu SA, Akorli J, Suzuki T. African Entomology 24(1) 236-240 (2016). doi: Gene Identifier similarity GMOY000040-RA ATPase GMOY010046 GMOY009081GMOY011252GMOY000041-RA protease capsid GMOY000668 GMOY009082他3GMOY000042-RA protease GMOY000043 他17GMOY000043-RA protease capsid GMOY000042 他17GMOY001867-RA DNA polymerase 他39GMOY011253-RA integrase GMOY011251paralogue10.4001/003.024.0236 査読有  8. Toxoplasma gondii infections among pregnant women, children and HIV-seropositive persons in Accra, Ghana. Ayi I, Sowah AO, Blay EA, Suzuki T, Ohta N, Ayeh-Kumi PF. Tropical medicine and health 44 17 (2016). doi: 10.1186/s41182-016-0018-5査読有   9. Congenital toxoplasmosis and pregnancy malaria detection post-partum: Effective diagnosis and its implication for efficient management of congenital infection. Blay EA, Ghansah A, Otchere J, Koku R, Kwofie KD, Bimi L, Suzuki T, Ohta N, Ayi I. Parasitology international 64(6) 603-608 (2015). doi: 10.1016/j.parint.2015.08.004 査読有   10. Ovipositional Behavior of Anopheles gambiae Mosquitoes. Agyapong J, Chabi J, Ablorde A, Kartey WD, Osei JH, de Souza DK, Dadzie S, Boakye DA, Ohta N, Hadi MP, Suzuki T. Tropical medicine and health 42(4) 187-190 (2014). doi: 10.2149/tmh.2014-13 査読有   11. Joint Research Project on Infectious Diseases in West-African Subregion. Ido E, Suzuki T, Ampofo WK, Ayi I, Yamaoka S, Koram KA, Ohta N. Journal of Disaster Research 9(5) 813-817 (2014). dsstr000900050813 査読有  〔学会発表〕（計 4件） 1. ガーナ共和国のネッタイシマカ個体群からアフリカ大陸初の電位依存性ナトリウムチャンネルのミューテーション（kdr）が発見された 川田 均, 邑並悠人, 比嘉由紀子, 鈴木高史, 皆川 昇 第 67回日本衛生動物学会 2015年 3月 金沢大学  2. ツェツェバエ defensin分子のハマダラカでの発現 和田良樹, 山本大介, 炭谷めぐみ, 松岡裕之, 太田伸生, 鈴木高史第67回日本衛生動物学会 2015年3月 金沢大学  3. 熱帯疾患コントロールへのアプローチ 鈴木高史 バイオナノシステムズ研究会 2016年1月 九州大学  4. 神戸常盤大学におけるグローバル教育の現況 鈴木高史 第 11回日本臨床検査学教育学会学術大会 2016年12月 神戸常盤大学  ６．研究組織  (1)研究代表者  鈴木高史（Suzuki Takashi） 神戸常盤大学・保健科学部・教授  研究者番号：70505530  (2)研究協力者 Egyir-Yawson Alexander Ghana Atomic Energy Commission, Accra, Ghana   

A novel approach for gene-manipulation of tsetse fly

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遺伝子組み換えツェツェバエの創出 : アフリカトリパノソーマ症制圧を目指して

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