αGal抗原は異種抗原として知られ,ヒトおよび旧世界サル以外の生物に広汎に存在し,異種移植における超急性拒絶反応の原因抗原と考えられている.このαGal抗原はα1-3 galactosyltransferase (α1-3GT)によって合成される.異種移植の分野では,α1-3GTを様々な方法で修飾することにより,移植可能な動物の作製が試みられている.本実験では,黒毛和牛からα1-3GTを単離し,これをαGal陰性のCOS-7細胞に導入し,我々のクローニングしたウシα1-3GTが機能するかどうかについて検討した.黒毛和牛末梢血から,RT-PCR法を用いてα1-3GTcDNAをクローニングした.これを,ネオマイシン耐性遺伝子を含むベクターに挿入し,αGal抗原発現ベクターを作製した(N3GA). N3GAをリポフェクション法により,αGal抗原陰性であるCOS-7細胞に導入した.N3GA導入翌日にIB4レクチンを用いた蛍光抗体染色を行った.N3GAを導入したCOS-7細胞(COS(+))では,αGal抗原陽性所見を認めた.また,N3GA導入2週間後に,同じくIB4レクチンを用いて行ったflow cytometryでもCOS(+)ではαGal抗原陽性所見を認めた.以上より,我々が黒毛和牛からクローニングしたα1-3GTは酵素機能を有しており,異種細胞においても機能することが示唆された.The polysaccharide antigen, called aGal epitope is ubiquitously found in all animals except for humans and old world monkeys. An αGal epitope is a main xenoantigen which hampers the success of the clinical xenotransplantation. The αGal epitope is synthesized by an enzyme, α1-3 galactosyltransferase (α1-3GT). Thus, disruption of the α1-3GT gene in large animals is one strategy for the successful xenotransplantation. In the present study, we isolated α1-3GT cDNA of Japanese Black Cattle (JBC), and transfected it into an α1-3GT negative COS-7 cell line to demonstrate that the cDNA was functional. The α1-3GT cDNA of JBC was amplified by a polymerase chain reaction. The α1-3GT cDNA was cloned to an expression vectors, named N3GA and transfected into α1-3GT negative COS-7 cells. Cell surface expression of αGal epitope was examined by immunofluorescent staining and flow cytometry with IB4 lectin. Transfected COS-7 cells were positive for the immunoreactive IB4 lectin examined at 24 hours after the transfection. Then, transfected COS-7 cells were selected with neomycin for 10 days. Flow cytometry of COS-7 cells performed 4 weeks after the transfection demonstrated positive log shift for αGal epitope. In conclusion, we isolated α1-3GT cDNA of JBC and obtained stable cell line expressing the gene
