周卫

张吉

张楚富

陆彬彬

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植物生理学通讯 第40卷 第6期，2004年12月 72l 测定植物组织中NH4 浓度的荧光法 陆彬彬 张吉 张楚富 周卫 武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室，生命科学学院，武汉430072 A Method for Determining Ammonium Ion in Plant Tissue by Fluorometry LU Bin．Bin，ZHANG Ji，ZHANG Chu-Fu ，ZHOU Wei Key Laboratory ofMinistry ofEducationfor Plant Developmental Biology,Colege ofLife Sciences，Wuhan University,Wuhan 430o72 提要 NH 与荧光试剂邻苯二醛(OPA)产生衍生作用后，用高效液相色谱"t~(HPLC)作荧光定量分析，可以在数分钟内快 速而准确地检测到植物组织提取液以及介质中的NH 含量。 关键词 铵离子；测定；荧光分析；谷氨酰胺合成酶 NH4 是高等植物的一种重要的氮(N)素营养和 氮素代谢的产物。植物根吸收外源 NH 后在谷氨 酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)和谷氨酸合 酶(glutamate synthase，GOGAT)构成的循环反应 中将其同化成谷氨酰胺和谷氨酸fl】。 通常认为，根吸收的外源NH4+大部分在根中 同化，只有少数转运到叶片中[21。叶片生理代谢 活动中产生的NH 也很快同化，不会在叶片组织 内积累。为了研究植物组织对 NH 的吸收及同化 和利用的效率，必须建立一种灵敏的方法，以便 能对组织抽提液和培养介质中的 NH 进行快速、 准确的测定。但是，通常采用的奈氏试剂法操作 繁琐、耗时，且易受到氨基酸、多胺类物质及 蛋白质的干扰而不准确，灵敏度和重复性也差。 邻苯二醛(OPA)可以同NH 发生衍生作用 (derivatization)r 。OPA是荧光试剂，将此反应与 HPLC相结合，可以检测 NH 。虽然此反应同样 也会受到某些因素的干扰，但是当pH值降至 6．8 左右、并加入2．巯基乙醇作为还原剂时，对 NH 的检出具有很强的专一性和极高的灵敏度H】。本 文介绍了此法的原理、操作过程，并且以在不同 温度下生长的水稻幼苗为材料进行了实例分析。 材料与方法 1实验材料 水稻(Oryza sativa)品种汕优 64经HgC12表面 消毒、浸种、催芽处理后移栽至含氮营养液 中 于 30℃人工气候箱中培养 5 d左右，进行如下处 理：一部分继续放在 30℃下生长；另一部分转 至低温 20℃中生长。湿度 为 60％～70％，光照 度为 60 mo1．m～．s～，每天光照 14 h。定时对水 稻生长的营养液取样，测定NH 浓度和 pH值。 以上处理 72 h后 ，将水稻根洗净 、吸干水 分、分装称重后置于低温冰箱中保存或立即用于 组织抽提。加入少许石英砂，按 1：3的比例加 抽提液于研钵中进行匀浆(4℃)。抽提液成分为： 100 mmol·L～Tris-HC1(pH 7．61、1．0 mmol·L。 EDTA、1．0 mmol·L～MgC12-6H2O、 10 mmol·L‘ 2．巯基乙醇。于4℃下 12000xg离心 30 min，收集 上清液，即为粗酶抽提液，用于 NH 浓度和GS 酶活性的测定 。 2 测定 2．1仪器 高效液相色谱仪(HPLC Agilent l 1 00 series， USA)。 2．2 oPA试剂 由磷酸盐缓冲液、OPA和巯基乙醇组 成，新鲜配制。各组分浓度如下：100 mmo1．L。磷 酸盐缓冲液、3 mmo1．L～OPA、l0 mmo1．L～2．巯 基乙醇 。磷酸盐缓冲液 由等摩尔 Na 2HPO 和 NaH2PO4组成，溶液的pH值为6．8。配制好的OPA 试剂以0．2 lxm微孔滤膜过滤后备用。 收稿 2004．03．1 8 修定 2004．06．28 资助 国家自然科学基金(30270l 30)。 通讯作~(E-m il：efzlwng@whu．edu．cI．Tel：027—87867314)。 维普资讯 http://www.cqvip.com 722 植物生理学通讯 第 40卷 第 6期，2004年 12月 2．3操作流程 参见文献3和4。OPA试剂流经HPLC 泵，含NH 样品由加样环注入。样品与OPA试 剂混合后，于63℃下发生衍生作用，产生荧光物 质，由HPLC的荧光监测器 自动检测并记录峰 值。流速 1 mL．min一，每个样品的检出时间大约 在 5 min左右。上样量 5 L。荧光检测的激发波 长和发射波长分别为410和470 nm。以不同浓度 的NH C1溶液作标准 曲线。 2．4 GS活性测定 GS滑l生测定参照文献6进行。1个 GS活性单位定义为于 37℃下每分钟催化产生 1 gmol 7-谷氨酰基异羟肟酸(~,-glutamylhydroxamate) 所需要的酶量。 实验结果 1标准曲线的制作 如图 1所示。在0~5 mmo1．L。NH C1范围内， 荧光值与NH C1浓度呈现非常好的线性正相关。 2 不同温度下水稻幼苗营养液中NH 和 pH值的 变化 对水稻营养液中的NH／和pH值进行了连续测 0 0．5 1．0 1．5 幺0 2．5 &0 &5屯0 屯5 5．0 5．5 1tlt4 cl浓度 ／衄Dl· 图1 NH 标准曲线 定，如图2所示。植物根组织吸收NH 的同时 释放出H ，因而营养液中NH 和pH显著下降。 20℃下两者下降的幅度大一些，显示在较低的温 度下，NH 吸收多些。 3不同温度下水稻根组织中NH 的积累 在水稻幼苗生长 72 h后，在 20和 30℃下， 根提取液中的 NH 浓度 分别是 0．3 8和 0．35 mmo1．L。(图3)。2O℃下生长的水稻根部 NI-I4+浓度 增高7％。与此同时，20℃下营养液中残留的NH 图2营养液中NH 浓度 (A)和pH值(B)变化曲线 30℃ 20℃ 、 、 螟 图3低温处理下水稻根粗抽提液中NH4~的积累 图4低温处理下水稻根粗抽提液中GS的活性 萼 弑莨罂 3  3  2  2  2  2  2  1  1  1  1  1  T-1．H昌I／毯璐．．重 1  1  1  O  O  O  O  O  皿̂陋一I-s_．I-lII皿．I昌i 6  5 4  3  2  1  O  O  O  O  O  O  O  I-1_H昌I／魁璐+r删 维普资讯 http://www.cqvip.com 植物生理学通讯 第 40卷 第 6期，2004年 l2月 723 浓度比30"C下减少 10％。营养液中iU4 的吸收与 根部 NH 的积累大体上是一致的。 4 不同温度下水稻根组织中的GS活性 低温明显促进 GS活性的增加(图4)。2O℃下 GS活性比3O℃下的提高 50％左右，说明低温有 助于 NH 的同化。这可能有助于解释水稻根中 NH4 积累与营养液中NH4 的降低之所以不完全成 对应关系的原因。因为在低温下生长的水稻根的 GS活性明显高于 30℃下的，而GS的高活性可以 加速NH 的同化，从而导致根提取液中NH 并 没有明显积累。这些结果表明较低的温度有助于 NH4 的吸收以及 GS活性的增高，而增高的GS活 性又可以反过来促进NH 的同化。 讨 论 本文的方法可以消除其它氮代谢物的干扰，且 重复性很好，灵敏度高。对于5和 20 uL的上样量 来说，其检测极限分别为 1．0和0．25 pmo1．L 【 。如 果把pH从 6．8升高至 l1．0，用SO ‘作为还原剂的 话，检测极限甚至可以达到0．02 1．tmo1．L ，这是常 规的化学检测法不能做到的【 。当然，这个检测极 限的增加是以NH 选择性的降低为基础的，可能 会受到某些特殊的氨基酸如 Gly、Ala、 Gln的严 重干扰 。 文中给出的OPA试剂配方适用于常规分析。 如果想得到更高的灵敏度，OPA的浓度可以增高 至 10 mmo1．L- 。如果需要更大的缓冲能力来维持 pH值的相对稳定(这与样品的pH有关)，可以将磷 酸盐缓冲液的浓度增至200 mmo1．L～。上样量主 要与灵敏度、线性范围以及样品的pH值有关，应 根据实际情况作具体调整。对于5 L乃至更小的 上样量来说，建议使用自动加样器，因为样品体 积的微小改变都可能导致荧光吸收值产生极大偏 差。另外一个值得注意的问题是保留时间。因为 无需过柱，OPA试剂与样品瞬间即可汇合，导致 保留时间太短，反应不充分。根据我们的经验 ， 对此可增加一段合适长度的塑料管，让缓冲液流 经该管再与样品反应以延长反应时间，同时对流 速加以控制。一般说来，保留时间应大于2 min。 参考文献 l Lea PJ．Blackwell RD．Joy KW ．Ammonia assimilation in higher plants．In：Mengel K，Pilbeam DJ(eds)．Nitrogen M etabolism of Plants．Oxford：Oxford Sci Pub1．1 992．289 2 Seshley KA．Yamaya T．Oaks A．Compartmentation of ni— trogen assimilation in higher plants．Int Rev Cytol，l 992， l 34：85一l63 3 Goyal SS，Rains DW ，Hufaker RC．Determination of am— monium ion by fluorometry or spectrophotometry after on—line derivatization with O-phthalaldehyde．Anal Chem， l988．60：l75~l79 4 Husted S，Hebbern C，M attsson M et a1．A critical experimen— tal evaluation of methods for determination of NH4 in plant tissue，xylem sap and apoplastic fluid．Physiol Plant，2000， l09：l67一l79 5 Yoshida S．Forno DA．Cock JH et a1．Laboratory M anual for Physiological Studies of Rice．3rd ed．M anila，Philippines： International Rice Reserarch Institute．1976．6l— 6 6 Rhodes D，Rendo GA，Stewart GR．The control of glutamine synthetase level in Lemna minor L．Planta．1975．125： 2Ol～2ll 7 Genfa Z．Dasgupta PK．Fluorometric measurement of aque— OUS ammonium ion in a flow injection system．Anal Chem， l989．6l：4084 l2 维普资讯 http://www.cqvip.com 

测定植物组织中NH4+浓度的荧光法

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