Jujoh Shio

Mogi Kazue

Takeuchi Shigeo

Toyoizumi Ryuji

竹内 重夫

茂木 和枝

豊泉 龍児

重城 志緒

茂木, 和枝

Mogi, Kazue

重城, 志緒

Jujoh, Shio

豊泉, 龍児

Toyoizumi, Ryuji

竹内, 重夫

Takeuchi, Shigeo

KANAGAWA University Repository

N両 生類胚における内臓左右軸成立機構の分子生物学的研究2001年 度総合理学研究所共同研究報告書N.一 両生類胚における内臓左右軸成立機構の分子生物学的研究 一茂木和枝、重城志緒、豊泉龍児、竹内重夫(責 任者)【研究の背景 と目的】degenerate-PCR法 によ り、ア フ リカツメガエル胚 か らCITEDフ ァミ リ0遺 伝 子の クローニ ングを試 みた。CITED(CBP/p3001nteractingTransactivatorwithED-RichC-termini)フ ァミ リーは、核ゲ ノム転写の際 にtransactivatorと して働 くタ ンパ ク質のグル ープであ り、 これ まで にCITED7,C'TED2,C,TED3,CI正D4が い くつかの脊椎動物 か ら単 離 されて いる。 これ らは、神経胚 期以降の成体 の さまざまな組織で発 現 し、心臓、生殖 腺、 四肢な どの形成 に関与す る とされ る。現在 報告 され て いる4つ のCITEDの うち、最 も多 くの種 で見つか って いるの はCITED2で 、ニ ワ トリ、 マウス、 ヒ トの胚 由来のcDNAが ク ローニ ング されて いる。ThomasSchlangeら(2000)は 、ニ ワ トリ胚 のCITED2が 、原条期 と呼ばれ る 三胚葉 が 出来て 間 もな い胚 形成 の初期 に、胚の右側方 の 中胚葉 のみ に発現 し、左側 のそれ には発 現 しな い ことを報告 した。 これ は、現在知 られる左右非 対称 に発現 す る遺伝子 の 中で も最 も早 い時期 に発現 する もので ある ことか ら、左右 非対称 性の決定 の分子 カスケー ドの 中で、他を支 配する上流 因子で ある ことが強 く期待 される。我 々が研 究材料 とする アフ リカツメガエル胚 は、遺伝子 の機能解析 に大変適 した材料であ るが 、ツ メガエル胚 か らはC'TED3の みが ク ローニ ングされ てお り、他 のC匿TEDは 未だク ローニ ング され て いな い。 そ こで、CITEDフ ァミ リー間で保 存性の 高 いアミノ酸領 域か ら設 計 したprimerを 用 いて、Xenopus胚 か ら新 規CITED,特 にCITED2の ク ローニ ングを試み た。【材料 と方法】(1)業 者 か ら購 入 し、 研 究 室 で 飼 育 ・馴 化 した ア フ リカ ツ メ ガ エ ル(Xenopus'eavis)の 雌 雄 成 体 に 、 生 殖 腺 刺 激 ホ ル モ ン(hCGH,帝 国 臓 器)を 注 射(♂200unit,♀400unit)し、 自然 に 受精 ・産 卵 さ せ た 。 卵 割 期 中 に、 チ オ グ リコ ー ル 酸 溶 液(pH=8.5)で ゼ リー 層を 除 去 し、 実 験 に用 い る発 生 段 階 ま で13～26℃ 、10%Steinberg氏 液 中で 飼 育 した 。(2)尾 芽胚 期(Nieuwkoop&Faber,1967に よ る発 生 段 階 表 のst.35-40)に 達 した胚30個 か ら単 離 ・精 製 したmRNAを1サ ン プル と し、RT-PCRを 行 った 。 塩 酸 グ アニ ジン法 に よ りtotalRNAを 得 て 、mRNA精 製 用oligo-dTカ ラ ム(宝 酒 造 社)でmRNAを 精 製した 。TaKaRaRNAPCRキ ッ ト(ver.2.1)を 用 いてmRNAをcDNAに 逆 転 写 後 、[熱 変 性一107一94℃1分 、 ア ニ ー リ ング55-65℃(温 度 勾 配 を か け た)1分 、 伸 長72℃1分 、40cycle]の 条 件 で 増 幅 した(一 部 の ク ロ ー ンはPCR条 件 が 異 な る)。primerと して 、 ① ニ ワ トリ、マ ウ ス 、 ヒ トのCITEDア ミ ノ酸 配 列 の ア ラ イ ン メ ン トフ ァイ ル を も と に 自 ら設 計 したforwardprimer,reverseprimer各5種 類 、 ② 論 文 中 に記 され て いたCITEDク ロ ー ニン グ 用 のforwardprimer2種 類(Sun,H.B.eta1.,1998;Leffers,H.etal.,2001)、並 び にGENETYX-MACのPCRプ ラ イ マ ー 部 位 解 析 で 、 そ れ ら に対 応 す る プ ライ マ ー の候 補と して 選 び 出 され たreverseprimer1種 類 を 用 い た 。 得 られ たRT-PCR増 幅 産 物 を1.5%ア ガ ロー ス ゲ ル 電 気 泳 動 し、DNA断 片 の 長 さを 確 認 した 。 そ して 予 想 の 長 さ の 断 片 の み 回収 した 。(4)MinEluteTMGelExtractionkit(QIAGEN社)に よ って 精 製 したDNA産物 をpGEM-TEasyVectorSysteml(Promega社)を 用 いて ラ イ ゲ ー シ ョン し、JM109系 統 のE.coliコ ン ピテ ン トセ ル に トラ ンス フ ォ ー メ ー シ ョン させ た 。 そ れ をS-galカ ラ ー セ ク シ ョン用 寒 天plateに ま き 、Whiteコ ロニ ーだ け を 選 択 し、ABIPrismMiniprepKit(AppliedBiosystems社)で プ ラス ミ ドDNAを 精 製 した 。 そ れ にBigDyeTerminatorCycleSequencingFSReadyReactionKit(ABI社)を 用 い てM13primerをprimerと して 、 サ イ ク ル シ ー ク エ ンス 法 によ って シ ー ク エ ン シ ング を行 った 。 得 られ た 塩 基 配 列 は 、BLASTサ ーチ を か け、DNAバ ンク に登 録 され た 塩 基 配 列との 相 同性 検 索 を 行 った 。【実験結果】RT-PCR実 験 に用 いた7pairのprimerpairの うち予 想 に近 い長 さのDNA断 片 の増幅 に成 功 した ものが4pairあ ったが、その うち2pairは 予想 と異な るサ イズの断片 も多数、ともに増 幅 されて いた。 その ほか に、予想 とは長 さが異な るが、なん らかのDNA断 片 が再現性を も って増幅 され たprimerpairが1pairあ った。DNA断 片を イ ンサー トしたクロー ン、43個 分の両鎖 の塩基配 列決 定の結果 、以下の表 に示 した通 りの既知の遺伝 子が得 られた 。primerの 配列1解 析クローン数1塩 基配列の解析結果forward;5'-TGGGCATGGGGCAGTTCSC-3'reverse;5'-TGAARTACTGGTTGTTGAGCTTCTG-3'注;我 々が 設 計 した(材 料 と方法 ①)7ferritincatatasetubu髄nβ 一1chainforward;5'-CAGACCGTTCACTT丁CAAGT-3'reverse;5'-TCCAGCCCCATTTCGATGACTAAGGACATGAGGA-3'注;forwardは 論 文 中 に記 され たprimer(材 料 と方 法②)20Xenopus神 経 胚 のEST★Xenopus卵 母 細胞 のESTfastmuscleATP-aseforward;5'-TCTCAGTGCTTCAGTGCTCCCAAGCAC-3'reverse;5'-TCCAGCCCCATTTCGATGACTAAGGACATGAGGA-3'注;forwardは 論 文 中 に記 され たprimer(材 料 と方 法②) 16myosinIIheavychainsynapticvesiclemembraneproteinnon-functionalfolatebindingproteinmyostatinsnapinselenoproteinp-likeprotein★_ESTと は、ExpressedSequenceTagの 略で、cDNA断 片 の配列で ジーンバ ンク等 に登録 された もの。塩基 配列決定 に いた らなか った ものや、insertを 含 まな いプ ラス ミ ドその もの(self一108一ligationし た もの)も 少数 あ った。以 上の結果 よ り、 これ らのprimerpairで はCITEDフ ァミ リーの遺 伝子 を増 幅す ることは困難で ある と考え られ る。【まとめと今後の展望】CITEDフ ァミ リーは脊椎動 物間で、 その アミノ酸 配列が非常 によ く保 存 され て いる。 中でも、最 も保 存 されて いる機能 ドメイ ンで あるCR2領 域 を認 識す るdegenerateprimerを設計 し、CR2ド メイ ンを有 するタ ンパ ク質 を コー ドす る遺 伝子 と してCITEDを ツメガエル胚か らク ローニ ングす るこ とを試 みたが 、primerのdegeneracyに 起 因するRT-PCR産物の 多様 性 に撹乱 されて しま い、 ツメガ エルCITED遺 伝子 の単離は 困難 であ った。primerの 設計 にあた り、高等 な脊椎動物 で あるニ ワ トリと数種 の哺乳類 のCITEDのア ミノ酸配列 を もとにdegenerateprimerを 設 計 したが 、既 に報告 され て いる小型硬 骨魚類 のゼ ブラ フィッシュのCITED3の ア ミノ酸配列 を重視 し、両生類 であ るツメガエルのCITEDの 配列を、 いわば魚類 と鳥類 ・哺乳類 の両側か ら"挟 み打 ちnに すれ ばよか ったのかも しれな い。 しか しなが ら、数種類 のprimerpairを もと に、様 々なPCR条 件の設定 を試み たが、RT-PCRの 再 現性が見 られ なか った り、バ ン ドが ラダー状 にな りPCR産 物 の ライゲー シ ョン以降の作業 に困難 をきた した りな どの我々の経験 か らは、CR2ド メイ ンを含むcDNAをdegeneratePCRで ク ローニ ングす るの は困難 で ある と予想 され る。degeneratePCR法 は、遺伝子 フ ァミ リーの未知の メ ンバ ーを ク ローニ ングする方法 と して多用 され るが、我 々の知 る限 り、CITEDの 仲 間をdegeneratePCR法 で クローニ ング した例 はな い。現 在、上記 の方法 とは全 く異な る、ESTク ローニ ング と呼ばれ る計算機科学 的なアプローチか ら、 ツメガエルCITED2の 遺伝子配 列の割 り出 しを行 って いる。その推定 配列か らdegeneracyを 含 まな いprimerpairをCR2領 域 を避 けて設計 し、 ツメガ エルCITED2の 部分配列 のク ローニ ング、ひ いて は全 長の ク ローニ ング を行 うことを計画 している。一109-一 一

<所内学術研究成果報告>N. 両生類胚における内臓左右軸成立機構の分子生物学的研究

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