Hino Akiya

Mizoguchi Hajime

Mogi-Toyoizumi Kazue

Takeuchi Shigeo

Toyoizumi Ryuji

日野 晶也

溝口 元

竹内 重夫

茂木-豊泉 和枝

豊泉 龍児

豊泉, 龍児

Toyoizumi, Ryuji

茂木-豊泉, 和枝

Mogi-Toyoizumi, Kazue

日野, 晶也

Hino, Akiya

竹内, 重夫

Takeuchi, Shigeo

溝口, 元

Mizoguchi, Hajime

KANAGAWA University Repository

D後 口動物胚における原腸形成のメ力ニズムの研究神奈川大学総合理学研究所2002年 度共同研究報告書申請区分:その他D.後 口動物胚における原腸形成のメカニズムの研究○研究組織学内メンバー;豊 泉 龍児(生物科学科助手)、茂木一豊泉 和枝(総理研客員研究員)、日野 晶也(生物科学科教授)、竹内重夫(生物科学科教授 ・責任者)学外メンバー;溝 ロ元(立 正大 ・社会福祉 ・生命科学/教 授)【研 究の 目的】受精 卵が卵割を繰 り返 し、やがて、 中空の上皮細胞 のシー トと しての胞胚 が形成 され る。オルガナイザー領域(形 成 中心)と よばれ る、体軸形成 に関連 した遺伝子の発現 が活性化 した領域が 胞胚 の一部 に生 じ、そ こを中心 に した形態形成運動 の結 果、外胚葉、 中胚 葉、内胚葉の三胚葉が形成 され、胚誘導 の連鎖の結果 と しての細胞分化 と 更な る細胞 増殖の結果 、胚発生が進行す る。このオル ガナイザ ー領域 に発現 する数多 くの遺伝子の 中で も、胚 の背側の決定 と背側 中軸 中胚葉の 形成 に必要な分泌 因子であるTGF-betasuperfami置yの 仲 間(NodalやDerriere,GDFな ど)は 、体 軸の形成 に主導的な役割 を果 たす。 しか しなが ら、面 白いことに、Nodalな どの背側中軸 中胚葉誘導 因子が働 き過 ぎな いよ うに、 ブ レーキの役割 を果たすLefty(図1左)やCerberusも また 、オル ガナイザー領 域 に局在す る ことが近年発見された。 これ らはオルガナイザ ー領域で転写が活性化 され る分泌 因子 として、同 じオルガナイザー領 域で分泌 され るもっとも重要な誘導 因子であるNodalタ ンパ ク質 とその リセプター との結合 を、細胞外で競合 的に阻害 する と予想 されて いる(図1右)。LeftyはTGF-betasuperfamilyに 属 し、同 じファミ リーの他の メンバ ー(2量 体)と は異な り、 おそ らく単量体の デ コイ と して、Nodal受 容体 をNodalを 相手 に奪 い合 うことで、Nodalシ グナル を負 に制御 する因子であ ることが、哺乳類 のマ ウス胚を用 いた解析 から予想 され ている。本研究 は、Nodalシ グナルの調節機構 を 発生生理 学的 に解 明す る ことを 目的 として、Leftyタ ンパ ク質 をツメガエル 胚の胞 胚腔 に微量注射 し、胚 の形態形成に対する影響 を調査 した。勢讐奮図1:ツ メガエル初 期原腸胚 の原 ロ背 唇部 にお けるleftymRNAの 発現(左 図矢 印)と 、LeftyのNodal抑 制機序(右 図).単 量体 と推定 され るLeftyはNodal受 容体を塞 ぐ。一85一【主要な実験結果】胚1個 あた り、6nanogram(ng)のLeftyを 胞胚腔 に注射す ると、前後軸方 向の体軸の伸長が 阻害 され 、両眼の間隔が著 しく狭 い例 や、胚頭端部で単眼 となる例 が高頻度で観察 され た(図2)。あ も　嘱難点籍 呼霧 ・撫・謬翫・2.、熱榔輔難纏・憐麗雛t灘転磁甑♂匡灘尋虐、.儲義雛、灘磯購図2:6ngのLefty蛋 白質を胞胚腔 に注射 した後の3日 胚。体軸の伸長が阻害 され、単 眼奇形を生 じて いる。[写 真撮影/竹内研卒研生 茂木美香氏]～od∂'やLefty)ま、魚類 、両生類、鳥類、哺乳類 の いずれ の脊椎 動物 にお いて も、体節期胚の左側の側板 中胚葉のみ に発現 し、右側の側板 中胚葉 には発現 しな い ことが知 られ ている。 いわ ゆる左右非対称な発現が脊椎動物 内で保存 されて いる。側板 中胚葉 におけるNodalの 発現 については、Nodalタ ンパク質 による 自己増 幅的な発現制御が行われ ることが知 られて いる。 この側板 におけるNodalの 発現 の過熱 を押 さえる抑 制因子 としてLeftyが左側で発現す るとされ る。 この説 明が 完全で あるな らば、右側 の側板 中胚葉 にLeftyタンパ ク質を微量注射 して も、何の変化 も生 じな いはずである。 ところが、体節 期胚の右一側板 中胚葉 に6ngのLeｬtyタ ンパ ク質 を微 量注射 する と、約7割 の注射 胚で内臓逆位が生じることが分か った(表 左)。 この結果 は、LeftyがNodalの アンタ ゴニス トであ るとす る従来の通説のみで は説 明が つかな い実験結果で ある。左側 の側板 中胚葉 に同量のLeftyタンパ ク質を注射 した場合 にも、約7割 の注射胚 に内臓逆位が生 じた。 こち らの結 果は、過剰量を投与 されたLeftyタ ンパク質が、胚の左側 に分布するNodalタ ンパ ク質の作用 を競合阻害 した結果で あると考 え られ る(表 右)。表1神 経胚側板 にLeftyタ ンパク質を注射する ことで得 られた 内臓逆位胚の比率(%)発生段階別 に集計 した。(内 臓逆位率の算出方法 は、Mogie亡 ∂/.2003に 従 った。)職lght 』eftstageneu耐astagestageneurulastage15-16117-181噛9-20 15-16117-18119暉20dOse(ng) Upper,%;Lower,inverted/survived dose(ng) Upper,%;Lower,inverted/survived67236/506229/477218/25s7035/507134/485012/24・・【考察と今後の展望】両眼の間隔が狭 くなった り、単眼となる表現型は、最前方の中軸中胚葉である脊索前板の形成不全によって生じることが、古くか ら知 られている。また、Lefty胞 胚腔注射胚が短躯となるのは、尾芽胚期に脊索の伸長運動がおこり体軸が急激 に伸長するが、そのプロセスに障害が生 じたためと考え られる。胞胚腔 に注射 したLeftyタ ンパク質は、従来か ら言われてきたようにNodalの 働きを阻害 した結果として、短躯や単眼の表現型をもた らしたと考えられる。今後、組織切片を作成 し細胞像を観察 した り、脊索特異的な分子マーカーで胚を染色することで、実際に脊索や脊索前板の形成が低形成 となっていることをチェックする必要がある。今後の課題としては、Leftyの 過剰投与が、原腸形成 における細胞の運動性の変化をもたらしたのか、それとも背側中軸中胚葉の分化を阻害 したのかを見極める実験を組む必要がある。本研究の本筋 に則った実験ではないが、右側板 中胚葉にLeftyタ ンパク質を投与することが内臓の左右決定に大きな影響を与えるという意外な結果を得た。その解釈として2っの可能性がある。一つは、Leftyは 、Nodalタ ンパク質が過剰量存在する場合 には その働きを抑制するが、Nodal遺 伝子が全 く発現 していない状態では、Nodalの 発現を誘導するという可能性である。もう一つの可能性は、Leftyに は胚の右側組織の分化に関わるシグナル伝達経路を抑制する働きがあ り、右側にLeftyタ ンパク質を注射 した時には、右側板の右分化が抑制 され、正常胚の中でのLeftyは(左 側板に分布することで)左側板の右分化を抑制 していた可能性である。Leftyタ ンパク質を右側側板に注射 した胚で、Nodalや そのカスケー ドの下流 に位置 し左側決定を行 う転写因子Pi亡x2の発現がどのように変化 しているかについて、(特定の遺伝子のmRNA発 現パターンを検出する方法である)ins'tohybridization法 を用いて調べることで、どちらの作業仮説が妥当であるのかを検討する必要がある。いずれにせよ、Leftyは 、ツメガエル原腸胚の形態形成や 神経胚の左右性決定 に深く関与 し、両生類胚の初期発生 に必要な分子であると考え られる。アンチセンス核酸法を用いて、Leftyタ ンパク質の合成をノツクダウンさせたツメガエル胚を作出し、Loss-of-functionの 方法論からも機能解析を掘 り下げたい。また、脊椎動物の起源動物である棘皮動物胚(ウニ、ヒ トデ)の仲間や、直接の祖先動物である原索動物(ホヤの仲間)の胚を材料 に、Lefty相 同遺伝子をクローニング し、その遺伝子発現パターンについて調べることは、意義深 いと思われる。一87一

後口動物胚における原腸形成のメカニズムの研究(2002年度共同研究プロジェクト)

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後口動物胚における原腸形成のメカニズムの研究(2002年度共同研究プロジェクト)

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