Kamano Yoshiaki

Suzuki Yoshihiro

釜野 徳明

鈴木 祥弘

釜野, 徳明

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Kamano, Yoshiaki

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鈴木, 祥弘

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Suzuki, Yoshihiro

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KANAGAWA University Repository

Q.新 バルブ資源植物ケナフ栽培品種18種 のrDNA領 域を用いた系統関係の解析Q新 パル プ資源 植物 ケナ フ栽 培品種18種 のrDNA領 域 を用 いた系統 関係 の解析総合理学研究所理学部生物科学科釜野 徳明鈴木 祥弘森林伐採は、二酸化炭素を吸収す る植物 を減少させ るばか りか、植物の有機物を大量の二酸化炭素として大気に放出させる。森林伐採は大気中の二酸化濃度上昇の主要因の一つである。森林伐採 の目的の一つであるパルプ生産を、荒地や耕作地で行 うことができれば、森林伐採 を減 らす ことがことができる。 これによ り、二酸化炭素濃度の上昇を低減 し、それ にともな う気候変動の抑制 に貢献できると考え られる。近年、二酸化炭素排出規制が国家間で検討され、森林伐採を低減す る様々な作物が注 目されてきた。ケナフは耕作地でのパルプ資源植物 として優良な性質 を持つ植物である。 しか し、ケナフはコス ト高な どか ら、実際にパルプとして利用 され ることが少なく、 このため、ケナフを有効に利用す るためには、多 くの研究すべき問題が残 されたままである。申請者 らは、世界各国の栽培品種18種 の種子を独 自に収集 ・栽培 しその特性の解析に着手 している。その結果、いくつかの品種 は各栽培地域に対応 した特徴的に有用な性質を持つ ことが示唆されている。 さらに多 くの品種 について特性を明かにし、その特性 を整理することができれ ば、ケナ フに認め られた優良な性質を様々な地域で有効に活用で きると考 え られる。栽培品種間の特性を比較 ・整理する上で、系統関係を明らかにす ることは重要である。しか しなが ら、原産地であるアフリカよ り作物 として世界中に広 まる課程 を示 した資料は残されてお らず、記録か らその系統関係を明 らかにすることは不可能である。また、DNA塩基配列を指標 とした解析 も、ケナ フ組織に含 まれる多量のポ リサ ッカロイ ドによるDNA精 製の難 しさか ら、その解析はほとんど行われて こなかった。本研究では比較的ポ リサ ッカロイ ドの含有量の少ないケナフ種子を用い、DNA塩基配列の決定に不可欠なDNA精 製法の確立 し、さらに、精製された全DNAか らポリメラーゼチェーンリアクション法(PCR法)を 用いて、近縁種の系統解析 にしばしば用いられるrDNA領 域 を増幅 した。世界 各地 よ り入手 した 、ケナフ栽 培品種18種 の種子 を冷蔵保存 し、必要 に応 じて使用 した。種子0.15gを15m1試 験 管 中で2.5M次 亜塩 素酸ナ トリウム に2分 間浸けた。そ の後 、滅菌水 で4回 洗浄 し、次亜塩 素酸 ナ トリウム を完 全 にのぞ いた。 この洗浄 によ り、種子 の周 囲に付着 して いる可能 性 のあ る微生 物 由来 のDNAを 除去した。洗浄 後 、乾熱滅 菌済 みの乳 鉢、乳棒 中で液体 窒素 を加 えなが ら種子 を十 分 に一163一磨 り潰 した。種子粉末 を5mlのDNA抽 出緩衝液(10mMTrisHCIpH8.0、150mMNaC1、10mMEDTA、0.1%SDS)に 加 えよ く撹搾 した後 、50m1のProtainaseK水溶液(20㎎/ml)を 加 え55℃ で1時 間静置 した。そ の後 さ らに50m1のProtainaseK水 溶液 を加 え55℃ で16時 間静置 し、混在す るタ ンパ ク質 を分解 した。種子 の破片な どを含 む沈殿物 をのぞ いた 上澄 を別 のプ ラスチ ック試 験管 に移 し、等量 の 中和フェノール を加 え、20分 間ゆ っ くりと撹搾 した。その後、25℃ 、3500rpm、10分間遠心 し、 変性 した タ ンパ ク質 を除去 した水 層 を別 のプ ラスチ ック試験 管 に移 し、等量 の中和 フェ ノー ル を加え、さ らに20分 間ゆっ く りと撹搾 した。25℃ 、3500rpm、10分 間遠心 し、変 性 した タンパ ク質 を除去 した水層 を別 のプ ラスチ ック試 験管 に移し、 フェ ノール の代わ りにク ロロフォルム ・イ ソア ミル アル コール の混 合液 を加 えて 、同 じ作 業 を繰 り返 し、水 層 に残 った フ ェノー ル を除去 した。 この水 層 を別 の試験管 に移 し、 これ に二倍体積 の100%冷 エ タ ノール を加 えてゆ っ くりと撹搾 し、核 酸を含む沈殿 を形 成 させた。 これ を4℃ 、3500rpm、10分 間遠 心 し沈殿 を集 め上澄 を除 いた後 、70%エ タ ノール を加 えて撹搾 し、再び4℃ 、3500rpm、10分 間遠心 し沈殿 を集 めた。 この作 業 をさ らに数回行 い、沈殿 に含 まれ る水 溶性 の不純 物 を溶解し、 核 酸 の純 度 を高 めた 。 沈殿 を常 温常 圧 で乾 燥 させ た後 、 適 量 のTris緩 衝 液10mMTrisHCIpH8.0、1mMEDTA)を 加 え37℃ で12時 間以上 静置 し、完全 に溶解 させた。以 上の方 法 によ りCTAB法 、Chelex法 、 ガ ラス ビーズ法で 不可能だったケナ フDNAを 大量 に精製す る ことに成功 した(図1)。本研 究で は、近縁種 間の系統解 析 に しば しば用 い られ る核ゲ ノム上のrDNA領 域を対 象 に、DNAの 増幅 を行 った。rDNA領 域 は5'端 側 よ りリボ ソーマルRNAを コー ドす る18S 、5.8S、26Sが 繰 り返 し数百 回列ぶ。 この18Sと5。8Sの 間にはITS1、5.8Sと26S問 にはITS2、26Sと18S問 にはN聡 の非 コー ド領 域が存在 す る。 これ らの非 コー ド領域 は、変異 が実 際 のrRNAに 反 映 しな い ことか ら、非常 に多様性に富 み変 化が大 き い。 アオイ 目の植 物数種 の この領域 にお ける既知 のDNA塩 基配列 を利用 し、ポ リメ ラーゼチ ェー ン リアクシ ョン法(PCR法)の 出発点 とな るプ ライ マー を設 計 した(表1>。 酵 素 としてTaqDNApolimeraze(PrernixExTaq、TaKaRa、Japan)を 選択 し、PCRThermalCycler(PCRthermalCyclerPERSONAL、TaKaRa、Japan)を 用 いて、様 々な条件で 反応 を行 った。DNA増 幅 の有 無 はアガロー ス電気泳 動で確認 した。そ の結果 、一定 の条件 で反応 を行 うことで 、上記 の精製DNAと プ ライマーでrDNA領 域 を増幅す る ことに成功 した(図3)。 反応条件 は種 ごとに異な る こと も明 らか にな った。 この増幅 したDNAを シー クエ ンス反応 の鋳型 として用 い、ITS1とrrs2領 域 を現在解 析中で ある。一164一表1ケ ナフrDNA増 幅のため設計したプライマー5` 3185FlTAGGGTTCGATTCCGGAGAG265RlTTCGCGCCACTGGCTTTTCA轟 嚇鞍L興 轟甑 勧麟鑓麓・lr難 盤㌔ ≒、"9考惑章謡図1 精製されたDNAの 電気泳動写真(最左のレuン は分子量マーカー)一165一器理縫溝激撫 羅鵬1講薄rDNA領 域1-1図2rDNA領 域 の構成図3PCRに よ り増 幅 され た ケ ナ フ のrDNA領 域(18SF1-26SR1)鋳 型 に はHibiscussabdariffaLcultivarKaewYaiよ り抽 出 され た 全DNAを 用 い た一166一

新パルプ資源植物ケナフ栽培品種18種のrDNA領域を用いた系統関係の解析(2002年度共同研究プロジェクト)

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新パルプ資源植物ケナフ栽培品種18種のrDNA領域を用いた系統関係の解析(2002年度共同研究プロジェクト)

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