Análisis comparativo de tres técnicas de derivación de células madre

Abstract

Las células madre embrionarias (Embryonic Stem Cells; ESC) son células pluripotentes que presentan la capacidad de dividirse indefinidamente a la vez que mantienen la habilidad para diferenciarse a cualquier tipo celular. Aunque de manera rutinaria se derivan a partir de la masa celular interna de embriones en estadio de blastocisto, también pueden derivarse a partir de embriones en estadios precompactacionales y de embriones reconstruidos por procesos de transferencia nuclear. Debido a que durante el desarrollo embrionario temprano, momento en el que se derivan las ESC, tienen lugar profundos cambios de metilación en el genoma, tanto la derivación como el cultivo se consagran como técnicas que pueden alterar los patrones de metilación en genes regulados por impronta genómica. Con el objetivo de analizar la estabilidad epigenética de embriones preimplantacionales y ESC murinas, en este trabajo se ha optimizado un protocolo de anàlisis de los niveles de metilación mediante pirosecuenciación. Para ello se han seleccionado tres genes regulados por impronta genómica (H19/Igf2, Snrpn and Peg3), dos genes relacionados con el mantenimiento de pluripotencia en ESC (Oct4, Nanog y Sox2) y dos genes marcadores de diferenciación temprana (Cdx2 y Gata6). Nuestros resultados muestran que algunos grupos de embriones preimplantacionales presentan una hipo e hipermetilación en las regiones diferencialmente metiladas (Differentially Methylated Regions, DMRs) de los genes Snrpn y Peg3. Además, la línea de ESC analizada presentó anomalías en los tres genes regulados por impronta genómica. No obstante, el hecho de que esta línea fuera inestable a nivel cariotípico no permite establecer una relación entre el cultivo in vitro o la técnica de derivación y la inestabilidad epigenética demostrada. Por todo esto, parece pertinente analizar tanto la integridad epigenética como la estabilidad cromosómica de ESC antes de proceder a realizar ensayos clínicos en humanos.Embryonic Stem Cells (ESC) are fully pluripotent and under appropiate culture conditions can proliferate indefinitely while retaining the ability to differentiate into all types of cells. ESC lines are conventionally isolated from the inner cell mass of blastocysts, however it has been demonstrated that ESC can be generated from cleavage stage embryos and via nuclear transfer (ntESC line) from adult somatic cells. Since ESC are derived from a period in mammalian development characterized by global epigenetic remodeling it is not clear whether their imprinted gene expression and methylation patterns would be stable or subject to variation upon derivation and subsequent culture. To address this question, we aimed to optimize a protocol to analyze the DNA methylation patterns in mouse ESC and preimplantational embryos by pyrosequencing. We examined the methylation pattern present in the Differentially Methylated Region (DMR) of three different imprinted genes (H19/Igf2, Snrpn and Peg3), in the promoters of the pluripotency marker genes (Oct4, Nanog and Sox2) and in the promoters of early differentiation marker genes (Cdx2 and Gata6). Our results show abnormal hypoand hyper-methylation within the Snrpn and Peg3 DMRs in preimplantation embryos. Also anomalies were found in the DMRs of all imprinted genes in the ESC line analysed. The use of an unstable ESC line hinders a direct correlation between the derivation method or in vitro culture and epigenetic instability. Overall, karyotipic and epigenetic stability are potential problems that must be addressed before ESC-based therapy is initiated