Universidad de Zaragoza, Prensas de la Universidad
Abstract
Introducción: El cobre (Cu) es un elemento esencial en la mayoría de organismos, aunque también puede ser tóxico a elevadas concentraciones (Festa y Thiele, 2011). En las plantas, el Cu participa en procesos fisiológicos como la fotosíntesis, la respiración mitocondrial, la percepción del etileno, el metabolismo de la pared celular, la protección frente al estrés oxidativo, la síntesis del cofactor de molibdeno y la regulación del ciclo circadiano (Puig y col., 2007; Mendel, 2013; Perea-García y col., 2010). Esto es debido a su habilidad para encontrarse en dos estados de oxidación diferentes in vivo, Cu+ y Cu2+. Por esta razón las plantas han desarrollado mecanismos para mantener la homeostasis, que permiten un eficiente uso del metal, a pesar del potencial daño que puede constituir para la célula (Ellingsen y col., 2007). En ella intervienen, transportadores de Cu de alta afinidad, metalochaperonas y ATPasas de tipo P (Ravet y Pilon, 2013). Muchos de los componentes de esta red han sido identificados y caracterizados durante los últimos años. Sin embargo, es necesaria más investigación en este campo para comprender completamente estos mecanismos. Por todo ello, el objetivo de esta Tesis Doctoral es el estudio de la homeostasis de Cu en plantas de soja (Glycine (G.) max), concretamente se ha realizado la caracterización de PAA2 (P-type ATPase in Arabidopsis 2), la ATPasa de tipo P1B encargada de transportar el Cu a través de la membrana tilaicoidal (Abdel-Ghany y col., 2005), y el estudio de la chaperona CCS (Copper chaperone for the Cu/Zn superoxide dismutase), encargada de la entrega del Cu a la Cu/Zn superóxido dismutasa (Pilon y col., 2011). Desarrollo: 1. Caracterización de PAA2. En la especie G. max, existen dos genes PAA2 (Bernal, 2006). Dichos genes, GmPAA2-1 y GmPAA2-2, tienen alta identidad entre ellos y se ha detectado un mecanismo de procesamiento alternativo en el gen GmPAA2-1, lo que podría conducir a la producción de una proteína completa (GmPAA2-1) y una proteína truncada (GmPAA2-1T). A su vez, el gen GmPAA2-2 retiene un hipotético intrón que produciría un codón de STOP prematuro y, por tanto, una proteína truncada. Utilizando la técnica de 5’ RACE, se vio que este gen tiene diferentes inicios de la transcripción según las condiciones nutricionales de Cu in vivo. Se ha realizado una caracterización de las proteínas GmPAA2-1 y GmPAA2-2 mediante la complementación funcional de los mutantes de S. cerevisiae ccc2, donde parecía que las proteínas GmPAA2-1, GmPAA2-1T o GmPAA2-2 no son capaces de complementar el fenotipo mutante. A su vez, en las levaduras silvestres, tampoco se observó un fenotipo apreciable por hipersensibilidad a cobre a consecuencia de la expresión de las proteínas de soja. Posteriormente se realizó la complementación del mutante paa1-1 de A. thaliana, que carece del transportador de Cu de la envuelta del cloroplasto (Shikanai y col., 2003), y se observó que las proteínas GmPAA2-1 y GmPAA2-2 no complementan el mutante paa1-1, indicando que las proteínas PAA1 y PAA2 tienen funciones que no se solapan. A continuación se realizó la complementación funcional del mutante paa2-1 de A. thaliana (Abdel-Ghany y col., 2005) con las proteínas GmPAA2-1 y GmPAA2-2. En este caso, GmPAA2-2 parece no complementar el fenotipo mutante paa2-1, en cambio, GmPAA2-1 es capaz de complementar el mutante paa2-1, lo que indica que la proteína de G. max es capaz de realizar la función de transporte de Cu+ a través de la membrana tilacoidal como en el caso de AtPAA2. Además, se ha estudiado la localización de GmPAA2-1 y GmPAA2-2 mediante expresión transitoria y estable de las proteínas fusionadas a YFP. Los datos indican que ambas proteínas tienen una localización cloroplástica. También se estudió la expresión de los genes mediante la técnica de qRT-PCR, y se vio que la expresión del gen GmPAA2-1 aumenta significativamente en algunas de las hojas según el aporte de Cu en la planta. En cambio, el gen GmPAA2-2 no parece mostrar una regulación por Cu. La localización in vivo de las diferentes proteínas GmPAA2 de soja se estudió mediante western blot con anticuerpos específicos. Los resultados mostraron bandas que podrían corresponder con las proteínas GmPAA2-1 y GmPAA2-1T, aunque no se observó la proteína GmPAA2-2. A pesar de ello, serán necesarios más estudios para conocer la función y caracterizar las nuevas posibles proteínas adicionales de soja. 2. Caracterización de la chaperona CCS de soja. La proteína GmCCS recombinante se sobreexpresó en E. coli y se purificó por cromatografía IMAC-Co2+ mayoritariamente en forma de apoproteína. Mediante estudios de interacción con su ligando por calorimetría isotérmica de titulación, se observó que la proteína GmCCS parece tener dos sitios de unión a Cu+ independientes con diferente afinidad y capacidad calorífica. La apoproteína GmCCS se encuentra en forma monomérica y dimérica, siendo más abundante la forma monomérica como indicaron los experimentos de cromatografía de exclusión molecular. La adición de Cu+ parece tener un efecto en el estado oligomérico, favoreciendo la dimerización de la proteína. Conclusiones: 1. La duplicación génica y los eventos de procesamiento alternativo pueden constituir un escenario favorable para la especiación, adaptación y evolución de las especies. En la especie G. max se han encontrado dos genes PAA2, con procesamiento alternativo en al menos uno de ellos, que podrían producir proteínas con funciones diferentes. Esto podría traducirse en una característica diferencial y, posiblemente, favorable para las plantas de esta especie. 2. Homólogos del gen PAA2 se han encontrado en todas las especies analizadas, lo que sugiere que su función es de gran importancia para las plantas. En soja, la proteína GmPAA2-1 parece realizar la función de transporte de Cu+ a través del tilacoide de manera similar a la proteína AtPAA2. A su vez, GmPAA2-1 tiene una función específica que no se superpone con la de PAA1 a pesar de compartir una gran similitud estructural con ésta. 3. La función de las proteínas adicionales GmPAA2 que podrían existir en la especie G. max es desconocida todavía. Es posible que realicen funciones alternativas al transporte de Cu+ a través de la membrana tilacoidal, pudiendo representar una característica positiva para las plantas que cuentan con ellas. Sin embargo, es necesaria más investigación para determinar estas cuestiones. 4. El mecanismo de actuación de la proteína CCS, así como su función de transferencia de Cu a su diana, Cu/ZnSOD, todavía cuentan con múltiples cuestiones por resolver. La proteína GmCCS parece encontrarse en dos estados oligoméricos diferentes (monómero y dímero), viéndose el dímero favorecido por la presencia de su ligando, Cu+. Esto podría tener una implicación en la interacción con la Cu/ZnSOD, mayoritariamente dimérica, en la que la transferencia del Cu podría producirse desde el sitio de unión a metal en el dominio III de GmCCS, con menor afinidad y mayor capacidad calorífica que el sitio de unión a metal en el dominio I
