Terapia gruźlicy, choroby zabijającej każdego roku setki tysięcy ludzi na całym świecie stanowi ogromny problem ze względu na rosnącą lekooporność bakterii na tradycyjne chemioterapeutyki. Szybka adaptacja M. tuberculosis do warunków środowiska, utrzymanie niektórych życiowych funkcji oraz liczne procesy metaboliczne mykobakterii są kontrolowane przez dwukomponentowe systemy transdukcji sygnału, składające się z zakotwiczonej w błonie komórkowej kinazy histydynowej oraz cytoplazmatycznego białka regulatorowego. Specyficzny sygnał ze środowiska prowadzi do autofosforylacji kinazy, a następnie przeniesienia reszty fosforanowej na wewnątrzkomórkowy regulator, który w odpowiedzi na sygnał reguluje ekspresję określonych genów. W komórkach M. tuberculosis obecne jest przynajmniej jedenaście dwuskładnikowych systemów oraz pięć „sierocych” białek regulatorowych, dla których partnerskie kinazy nie zostały dotąd zidentyfikowane. W niniejszej pracy analizie poddano dwa z takich regulatorów: białko Rv0195 i Rv0260c (Msmeg_0432 u M. smegmatis). Badania miały na celu określić funkcję badanych czynników transkrypcyjnych u M. tuberculosis oraz ocenić niezbędność genów je kodujących w komórce bakteryjnej. Do zaplanowanych eksperymentów wykorzystano szczepy M. tuberculosis i M. smegmatis.
Oceny niezbędności genów rv0195 i rv0260c w komórkach M. tuberculosis oraz genu msmeg_432 w komórkach M. smegmatis dokonano przez próbę konstrukcji ukierunkowanych mutantów pozbawionych zdolności syntezy funkcjonalnych białek. Zastosowanie techniki opartej o rekombinację homologiczną pozwoliło uzyskać mutanty o pożądanym fenotypie ostatecznie potwierdzając, że badane geny nie są niezbędne do przeżycia mykobakterii.
Mutanty Δrv0195 i Δrv0260c M. tuberculosis poddano wstępnej analizie polegającej na ocenie wzrostu i przeżywalności szczepów w obecności reaktywnych form tlenu i azotu generowanych przez menadion i DETA-NO. Badania te wykazały, że mutant Δrv0195 hodowany z rodnikami nie wykazuje różnic w kinetyce wzrostu i żywotności w stosunku do szczepu dzikiego, jednakże hodowany bez związków charakteryzuje się osłabioną przeżywalnością w stacjonarnej fazie wzrostu oraz opóźnionym tworzeniem się kolonii na podłożu stałym. Mutant Δrv0260c wykazał natomiast znacząco wyższą żywotność w obecności menadionu, porównując badany parametr między mutantem a szczepem dzikim hodowanym w takich samych warunkach.
W kolejnych badaniach, dwiema metodami oceniono wrażliwość szczepów Δrv0195 i Δrv0260c M. tuberculosis na wybrane tuberkulostatyki oraz inne związki. W testach na podłożu stałym oba mutanty wykazały zwiększoną w stosunku do szczepu dzikiego wrażliwość na streptomycynę, dihydrostreptomycynę i izoniazyd, jednak takich różnic nie zaobserwowano badając działanie antybiotyków w hodowlach płynnych.
Z wykorzystaniem metody immunodetekcji wykazano, że w warunkach optymalnych dla wzrostu prątków gruźlicy białko Rv0260c występuje w komórkach w bardzo małych ilościach, poniżej progu detekcji.
Dalsze analizy dotyczące regulatora Rv0260c przeprowadzono na modelu M. smegmatis, w genomie którego obecny jest gen kodujący białko Msmeg_0432, homolog czynnika transkrypcyjnego Rv0260c. Zaplanowane doświadczenia miały na celu poznanie funkcji białka w metabolizmie związków azotowych, uwzględniając rolę globalnego regulatora metabolizmu azotu Msmeg_5784, bezpośrednio kontrolującego ekspresję genu msmeg_0432. Zastosowane dla mutanta Δmsmeg_0432 M. smegmatis analizy fenotypowe systemem BIOLOG oraz profilowanie transkrypcyjne szczepów Δmsmeg_0432 i Δmsmeg_5784 hodowanych w warunkach głodu azotowego wykazały udział białka Msmeg_0432 w asymilacji azotanów i azotynów oraz detoksyfikacji komórki z tlenku azotu. W hodowlach w podłożu płynnym potwierdzono, że mutant Δmsmeg_0432 nie jest zdolny do wzrostu, kiedy jedynym źródłem azotu w środowisku jest azotan lub azotyn sodu. Oceniając stężenie azotynów i jonów amonowych w hodowlach z azotanem sodu dowiedziono, że mutant jest zdolny do redukcji azotanów, natomiast zaburzeniu w komórce uległy szlaki konwersji azotynów do amoniaku.
Globalna analiza transkryptomu pozwoliła określić regulon białka Msmeg_0432, kontrolowany przez czynnik transkrypcyjny w odpowiedzi na zużycie środowiskowego azotu. Wykazano także, że białko Msmeg_0432 wiąże się do sekwencji promotorowych regulowanych genów w pobliżu miejsca wiązania białka Msmeg_5784 wskazując na występowanie mechanizmu współregulacji. Badając oddziaływania rekombinowanych białek MBP-Msmeg_0432 i His-Msmeg_5784 z sekwencjami promotorowymi wybranych genów, stosując pojedyncze białka lub ich mieszaninę potwierdzono, że obecność globalnego regulatora jest wymagana do związania przez białko Msmeg_0432 niektórych sekwencji promotorowych. Analiza oddziaływania potencjalnych współregulatorów wykazała natomiast słabą interakcję między rekombinowanymi białkami.
Uzyskane wyniki pozwalają stwierdzić, że białko Msmeg_0432 jest niezbędne w komórkach M. smegmatis do asymilacji azotu pochodzącego z azotanów i azotynów. Biorąc pod uwagę analizy z udziałem mutantów M. smegmatis i M. tuberculosis istnieje także duże prawdopodobieństwo udziału regulatora w odpowiedzi komórki na stres nitrozacyjny oraz oksydacyjny, warunków przypominających wewnątrzkomórkowe środowisko prątków gruźlicy.Grant 2013/11/D/NZ6/02888 NCN SONATA
