Stężenie jonów wodorowych (pH) i benzodiazepiny (BDZ) są czynnikami
modulującymi receptory GABAa. W szczególności, wartość pH środowiska
zewnątrzkomórkowego może zmieniać się w zależności od stanu
fizjologicznego lub patologicznego. W niniejszej pracy przedstawiono wyniki
badań wpływu flurazepamu (benzodiazepiny) przy różnych wartościach
zewnątrzkomórkowego pH (z zakresu 5.5 - 7.2) na amplitudę miniaturowych
GABA-ergicznych inhibujących prądów synaptycznych (mIPSCs). Stwierdzono,
że obecność flurazepamu prowadzi do zwiększenia amplitudy mIPSCs, ale efekt
ten zależy od pH i je st największy przy silnie kwaśnych wartościach. Wpływ
flurazepamu na amplidudę mIPSC osiąga nasycenie przy stężeniu ok. I цМ dla
wszystkich badanych wartości pH. Wyniki te wskazują na to, że modulacja
Prądów GABAergicznych przez benzodiazepiny jest zależna od odczynu
środowiska.Praca dofinansowana przez KBN grant nr PBZ-M1N-001/P05/28Zadanie pt. „Digitalizacja i udostępnienie w Cyfrowym Repozytorium Uniwersytetu Łódzkiego kolekcji czasopism naukowych wydawanych przez Uniwersytet Łódzki” nr 885/P-DUN/2014  dofinansowane zostało ze środków MNiSW w ramach działalności upowszechniającej naukę

Brzeźnicki, Piotr

Mozrzymas, Jerzy W.

Piast, Michał

Pindel, Ewa

Wójtowicz, Tomasz

Folia Biologica et Oecologica

Polish

Repozytorium Uniwersytetu Łódzkiego (University of Lodz Repository)

Wpływ Hura/ćpaniu i zewnątrzkomórkowego pH na amplitudę i kinetykę GABAergicznych prądów synaptycznych  w hodowanych neuronach z hipokampa szczura*Piotr Brzeźniaki, Ewa Pindel, Tomasz Wojtowicz, M ichał Piast,Jerzy W. MozrzymasSamodzielna Pracownia Biofizyki Układu Nerwowego Katedra Biofizyki Akademia Medyczna we WrocławiuStreszczenieStężenie jonów  wodorowych (pH) i benzodiazepiny (BDZ) są  czynnikami modulującymi receptory GABAa. W szczególności, wartość pH środowiska zewnątrzkomórkowego może zmieniać się w zależności od stanu fizjologicznego lub patologicznego. W niniejszej pracy przedstawiono wyniki badań wpływu flurazepamu (benzodiazepiny) przy różnych wartościach zewnątrzkomórkowego pH (z zakresu 5.5 -  7.2) na amplitudę miniaturowych GABA-ergicznych inhibujących prądów synaptycznych (mIPSCs). Stwierdzono, że obecność flurazepamu prowadzi do zwiększenia amplitudy mIPSCs, ale efekt ten zależy od pH i je st największy przy silnie kwaśnych wartościach. Wpływ flurazepamu na amplidudę mIPSC osiąga nasycenie przy stężeniu ok. I цМ dla wszystkich badanych wartości pH. Wyniki te wskazują na to, że modulacja Prądów GABAergicznych przez benzodiazepiny jest zależna od odczynuśrodowiska.Słowa kluczow e: flu razepam , benzodiazepiny , pH, receptory GA BA a , patch-clamp, mIPSC.Benzodiazepiny są związkami, które wspomagają aktywność receptorów GABAa  [4, 9, 14]. Do tej grupy związków należą substancje stosowane jako leki Przeciwepileptyczne (AED), przeciwkonwulsyjne, leki nasenne i uspokajające. Receptor GABAa  zawierający podjednostkę y2 posiada miejsce wiążące dla benzodiazepin, które znajduje się na interfejsie pomiędzy podjednostką y2 i ot t9. 11, 12, 13], co pozwala na bezpośrednią modulację działania receptora przez te związki. Głównym efektem oddziaływania benzodiazepin na receptor GABA*Praca dofinansow ana przez  KBN grant nr PBZ-M 1N-001/P05/28jest zwiększenie powinowactwa GABA do receptora GABAa  (GABAa R) [1]. W praktyce, najczęściej opisywanym efektem benzodiazepin jest zwiększenie amplitud i wydłużenie czasu deaktywacji prądów GABAergicznych [4, 2].Innym czynnikiem, który silnie moduluje funkcjonowanie GABAaR jest stężenie jonów  wodorowych w bezpośrednim otoczeniu receptora [3, 8, 10]. Zakwaszenie roztworu powoduje redukcję amplitudy (przy b. niskich stężeniach GABA). pH jest jednym z parametrów, który może ulec zmianie w stanach chorobowych, patologicznych układu nerwowego, co z kolei może wpływać na efektywność działania leków, związków modulujących działanie receptora GABAa  [14]. Praca ta stara się odpowiedzieć na pytanie, jaki wpływ na modulację synaptycznych prądów GABAergicznych przez benzodiazepiny mają zmiany pH w środowisku zewnątrzkomórkowym.Badania przeprowadzono na hodowlach komórek nerwowych, pochodzących z hipokampa szczura (2-3 dni po urodzeniu). Procedura preparacji hodowli została przedstawiona w szczegółach w pracy [7]. 2-3 dniowe szczury zostały zdekapitowane, hipokamp został wyekstrahowany, pocięty, potraktowany enzymami trawiącymi i zdysocjowany na pojedyncze komórki, które wysiane zostały na płytkach Petriego i pozostawione w inkubatorze przez przynajmniej tydzień. W tym czasie, dochodzi do wytworzenia dużej ilości funkcjonalnych połączeń synaptycznych. Pomiary wykonano przy użyciu techniki patch-clamp, w konfiguracji whole-cell, rejestrując miniaturowe, inhibujące prądy postsynaptyczne (mIPSCs), przy obecności blokerów: tetrodotoksyny (TTX, 1 Ц.М) blokującej napięciowozależne kanały sodowe, i kwasu kinurynowego (1 mM) blokującego transmisję glutamatergiczną (AMPA i NMDA). Rejestracje wykonano przy stałym, ustalonym na -70 mV napięciu błonowym.Roztwór zewnątrzkomórkowy miał następujący skład: NaCI 137 mM, KC1 5 mM, CaCl2 2 mM, M gCl2 1 mM, D-glukoza 20 mM, HEPES 10 mM, pH roztworu doprowadzone do odpowiedniego pH (6.0 -  7.2) przy użyciu NaOH. Dla pH = 5.5, zamiast buforu HEPES użyty został bufor MES 15 mM. Pipeta pomiarowa wypełniona była roztworem o składzie: CsCl 137 mM, СаСЬ 1 mM, MgCl2 2 mM, BABTA 11 mM, ATP 2 mM, pH = 7.2 miareczkowane przy użyciu CsOH.Roztwór standardowy, o danym pH i ustalonym stężeniu flurazepamu, podawano w bezpośrednie otoczenie badanej komórki. Prądy synaptyczne wykazywały bardzo duże zróżnicowanie zarówno jeśli idzie o amplitudę jak i przebieg czasowy (Ryc. 1A) dlatego też w celu ich opisania każdorazowo dokonano ich algebraicznego uśrednienia (Ryc. IB). Do akwizycji i analizydanych wykorzystano pakiety programowe clampex 9.2 i clampfit 9.2 (Axon Instruments).Ryc. 1. P rzykładowe re jestracje m IPSC d la różnych wartości pH (A) oraz uśrednione wartości Prądów mierzonych w danych warunkach (B). W artości względnej amplitudy min iaturowych prądów synaptycznych d la  różnych wartości pH zew nątrzkom órkow ego (zmierzone z przynajmniej n =  3 komórek) (C).Stosując wyżej opisaną metodologię, dokonano analizy zależności amplitudy miniaturowych prądów synaptycznych od zewnątrzkomórkowego pH i stężenia flurazepamu. Wartość średniej amplitudy dla kontrolnego pH = 7.2 wyniosła44.8 ± 1.3 pA (n = 50). Stwierdzono, że zmniejszające się pH powoduje początkowo wzrost amplitudy mIPSC (dla pH = 6.5), ale dalsze zmniejszanie wartości pH prowadzi do zmniejszenia tego parametru [Ryc. 1C]. Wyniki te potwierdzają efekt jonów  wodorowych na prądy GABAergiczne opisany w pracach [3, 8]. Flurazepam zwiększał amplitudę mIPSCs, ale efekt ten był zależny od wartości pH. Ryc. 2A-D przedstawia względne zmiany amplitud (względem średniej amplitudy mIPSCs zmierzonej przy pH = 7.2 na tej samej komórce) przy różnych wartościach pH i stężeniach flurazepamu.A ВpH 5.5aпи цМ [flur], pH 6.0 °500 msС 1.5 pHe 6.5a  1.0с0.0I 1014сIS’ 0.6 spH=5.51 fiM »им 10 |iMpH=6.5 1 mM 3 (iMВpH=6.01 (.M 3 MM 10 (JV1DI  ’■»S' 0.5pH=7.2—  pH = 5.5 1 = 1  pH = 6.0 И222 pH « 6.5 SÜS2S1 pH -  7.2Ryc. 2. W ykres zależności względnej amplitudy mIPSC od stężen ia  flu razepam u (przeryw aną lin ią zaznaczono poziom odpowiadający wartości względnej am plitudy [IpH+ п11Г1т.ршп/ IpH=7 2J dla pH =  7.2) d la (A) pH =  5.5, (B ) pH =  6.0, (C) pH =  6.5 i (D) pH =  7.2, (E ) w zględna wartość amplitudy (m ierzone względem pH kontrolnego =  7.2), (F) w artość względnej am plitudy [IpH + йипшфшц/ I,,h1 odniesionej do danej wartości pH.Największy wpływ flurazepamu na amplitudę stwierdzono przy wartości pH = 5.5: choć średnia amplituda mIPSCs przy pH = 5.5 i nieobecności flurazepamu uległa zmniejszeniu do 0.75 ± 0.05 (n = 5, względem amplitud przy pH kontrolnym równym 7.2) to przy stężeniu 3 цМ flurazepamu amplituda wzrastała do 1.45 ±  0.02 ( n = 3) (Ryc. 2A). Dla porównania, przy pH = 7.2 i stężeniu flurazepamu 3 цМ wystąpił wzrost amplitudy do 1.21 ±  0.09 (n = 4)[Ryc. 2D]. Wyniki te wskazują na bardzo ważną obserwację, że wpływ flurazepamu na amplitudy mIPSCs jest uzależniony od wartości pH w środowisku zewnątrzkomórkowym. Zależność efektu flurazepamu od pH jest jeszcze lepiej widoczna na [Ryc. 2E] przedstawiającym wpływ flurazepamu na amplitudę mIPSCs mierzoną i odnoszoną do wartości amplitud dla określonego pH (przy nieobecności flurazepamu). Wzrost amplitudy przez flurazepam zależał monofonicznie od pH i dla 1 цМ flurazepamu przy pH = 5.5 względna amplituda wyniosła 1.81 ± 0.06 ( n = 3), przy pH = 6.0 1.34 ± 0.09 ( n = 3), przy pH = 6.5 1.22 ±  0.03 (n = 3) i przy pH 7.2 1.20 ± 0.02 (n = 5).Stężenie 1 цМ flurazepamu okazało się być wystarczające do nasycenia efektu wzrostu amplitudy -  jak widać na (Ryc. 2A-D) dalsze zwiększanie stężenia nie wywołuje znaczących zmian w wartości amplitudy.Przedstawione wyniki pokazują, że flurazepam wpływa na zwiększenie amplitudy mIPSC, a efekt oddziaływania flurazepamu jest zależny od wartości pH przy jakim  to oddziaływanie zachodzi. Bardzo wyraźnie widoczne jest, że zmniejszenie stężenie protonów (zakwaszenie roztworu), powoduje silne zwiększenie wpływu flurazepamu, co może sugerować, że w niższych wartościach pH następuje łatwiejsze wiązanie się tego związku do receptora GABA i przez to s i l n i e j s z ą  modulację jego funkcjonowania. Efekt ten może być także związany z przyjmowaniem przez flurazepam różnych właściwości zależnych od pH np. uprotonowania, dimeryzacji, wpływających na możliwość wiązania się związku oraz jego właściwości modulacyjne. Ta możliwość jest jednak mało prawdopodobna ze względu na to, że wartość pKa dla flurazepamu wynosi 8.16, co sugeruje iż zakwaszanie roztworu poniżej wartości kontrolnej (7.2) nie powinno istotnie wpływać na uprotonowanie flurazepamu. Jest możliwe, że różny wpływ flurazepamu na amplitudy mIPSCs przy różnych wartościach pH jest konsekwencją nakładania się wpływu tych dwóch czynników w warunkach bardzo krótkiej ekspozycji receptorów na synaptycznie wydzielony GABA. Przy silnie kwaśnych pH, stała wiązania staje się tak powolna, że bardzo krótkotrwała ekspozycja receptorów synaptycznych na neuroprzekaźnik (czas przebywania neuroprzekaźnika w synapsie jest szacowany na ok. kilkaset mikrosekund, [15]) jest niewystarczająca by doszło do aktywacji receptorów w takim stopniu jak ma to miejsce w warunkach kontrolnych. Pojawienie się flurazepamu przy kwaśnym pH odwraca efekt zakwaszenia środowiska na stałą wiązania. Należy jednak podkreślić, że niska wartość pH wpływa ponadto na zmniejszenie desensytyzacji [3]. A zatem, sumaryczne działanie obniżonego pH i flurazepamu może doprowadzić do zmniejszenia desensytyzacji przy niezmienionym lub nawet zwiększonym powinowactwie receptora GABAa do jego agonisty (wpływ pH i flurazepamu nastałą wiązania się kompensują). W tej sytuacji, wydzielony synaptycznie agonista, przy niskim pH i w obecności flurazepamu, może doprowadzić do znacznego wzrostu amplitudy mIPSCs, gdyż większa proporcja związanych receptorów przejdzie do stanu konformacyjnego otwartego kosztem stanu zdesensytyzowanego (patrz dyskusja o mechanizmie wpływu pH na receptory GABAA w parcy [3]).Konkludując, najważniejszym wnioskiem z niniejszej pracy jest to, iż flurazepam silnie moduluje GABAergiczne prądy synaptyczne i efekt ten jest bardzo istotnie modulowany przez zmiany wartości pH środowiska zewnątrzkomórkowego. Obserwacja ta wydaje się bardzo ważna, gdyż jak już  wspomniano we wstępie, wartość pH roztworów zewnątrzkomórkowych może ulegać istotnym zmianom w różnych stanach fizjologicznych i patologicznych.Piśmiennictwo1. Dian-Shi W ang,a, Shun-Y an Lu, Zhen Hong and Hai-Lei Z hua (2003) Biphasic action of m idazolam on GABAA reccptor-m cdiated responses in rat sacral dorsal commissural neurons. B iochem ical and  B iophysica l Research Com munications. 309 (2003) 893-899 .2. Reynolds J. N.. M aitra R. (1996) Propofol and flurazepam act synergistically to po tentiate GA B Aa recep tor activation in human recom binant receptors. European  J. o f  P harmacology  314 151-156.3. M ozrzym as J.W., Ż am ow ska E.D., Pytel M., M ercik K. (2003). M odulation  o f GA BAa receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role o f the desensitiza tion process. J.N eurosci. 23: 7981-7992.4. Poncer J.C., Durr R., G ahw iler B.H. and Thompson S .M.. M odulation o f Synaptic G AB Aa Receptor Function by Benzodiazepines in Area CA3 o f Rat Hippocampal Slice Cultures. N europharm acology. Vol. 35. No.9/10 1169-1179.5. M .V., W estbrook G.L. (1995) Desensitized states pro long G A BA a channel responses to b rief agonist pulses. N euron  15: 181-191.6. M ing-De W ang, M ozibur Rahman, Di Zhu, (2005) P rotons inh ibit Cl conductance by direct o r allosteric in teraction with the BAG A-binding site in the rat recom binant antl cx,ß2 GA B Aa recep tor. Euro. J. o fP h arm .  528 I -  6.7. A ndjus P .R.. S tev ic-M arinovic Z., C herubini E. (1997) Im munoglobulins form  m otoneurone disease patients enhance glutam ate release from rat hippocam pal neurons in cu lture, 504 103- 112 .8. Pasternack M., Smirnov S., Kaila K. (1996) Proton M odulation o f  Functionally Distinct GA B Aa Receptors in Acutely Isolated Pyramidal N eurons o f  Rat Hippocampus. N europharm acology  Vol. 35, No. 9/10. 1279 -  1288.9. W afford K.A. (2005), G A B Aa recep tor subtypes: any c lues to the mechanism  of benzodiazep ine dependence? Current Opinion in Pharm acology  5: 47 -  52.10. Krishek B.J., Amato A. (1996), Proton sensitivity o f the G A BA a recep tor is associated with recep tor subunit composition . J. Physiol. 492 ( Pt 2 ):43 1 -43.11. Berezhony D., Nyfelet Y., G onth ier A. (2004) On the Benzodiazep ine  Binding  Pocket in GABAA Receptors. J. Biolog. Chem. Vol. 279, No. 5 3 1 6 0 -3 1 6 8 .12. Ogris W., Poltl A., Sieghard  W., (2004) Affinity o f  various benzodiazep ine  site ligands in m ice with a poin t m utation in the GA BAa receptor y2 subunit. B iochem ical P harm acology  68 1621-1629 .13. Boileau A.J., Baur R., Sharkey E., Singel E., Czajkowski C. (2002) T he rela tive am ount o f cRNA coding for g2 subunit affects stimulation by benzodiazep ines in G A B Aa receptors expressed in X enopus  oocytes. N europharm acology  43 695 -  700.14. B orchardt M. (1999) Review o f the clinical Pharm acology and use o f the benzodiazep ines. J. P erianesthesia Nursing, Vol. 14 No. 2 65 -  72.15. M ozrzym as J.W. (2004) Dynamism o f G AB Aa recep tor activation shapes the “personality” o f  GA B Aa recep tor activation shapes the “personality” o f inh ib itory synapses. Neuropharm acology, 47  945-960 .Adres do  korespondencji: P io t r B rzeźnickiSam odzie lna Pracow nia  Biofizyki Układu NerwowegoKatedra Biofizyki Akademia M edyczna we W rocławiu ul. C hałubińskiego 3 50-368 Wrocław T el.:(4 8  71)7841551 e-mail: pbrzez@ interia .pl

Wpływ fłurazepamu i zewnątrzkomórkowego pH na amplitudę i kinetykę GABA ergicznych prądów synaptycznych w hodowanych neuronach z hipokampa szczura

Stężenie jonów wodorowych (pH) i benzodiazepiny (BDZ) są czynnikami
modulującymi receptory GABAa. W szczególności, wartość pH środowiska
zewnątrzkomórkowego może zmieniać się w zależności od stanu
fizjologicznego lub patologicznego. W niniejszej pracy przedstawiono wyniki
badań wpływu flurazepamu (benzodiazepiny) przy różnych wartościach
zewnątrzkomórkowego pH (z zakresu 5.5 - 7.2) na amplitudę miniaturowych
GABA-ergicznych inhibujących prądów synaptycznych (mIPSCs). Stwierdzono,
że obecność flurazepamu prowadzi do zwiększenia amplitudy mIPSCs, ale efekt
ten zależy od pH i je st największy przy silnie kwaśnych wartościach. Wpływ
flurazepamu na amplidudę mIPSC osiąga nasycenie przy stężeniu ok. I цМ dla
wszystkich badanych wartości pH. Wyniki te wskazują na to, że modulacja
Prądów GABAergicznych przez benzodiazepiny jest zależna od odczynu
środowiska

Mozrzymas, Jerzy W

Biblioteka Nauki - repozytorium artykuÅÃ³w

http://dspace.uni.lodz.pl:8080/xmlui/bitstream/11089/12167/1/Biologica%20et%20Oecologica%2003%202006%2047-53.pdf

Wpływ fłurazepamu i zewnątrzkomórkowego pH na amplitudę i kinetykę GABA ergicznych prądów synaptycznych w hodowanych neuronach z hipokampa szczura

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Repozytorium Uniwersytetu Łódzkiego (University of Lodz Repository)

Biblioteka Nauki - repozytorium artykuÅÃ³w

Wpływ fłurazepamu i zewnątrzkomórkowego pH na amplitudę i kinetykę GABA ergicznych prądów synaptycznych w hodowanych neuronach z hipokampa szczura

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Repozytorium Uniwersytetu Łódzkiego (University of Lodz Repository)

Biblioteka Nauki - repozytorium artykuÅÃ³w

Biblioteka Nauki - repozytorium artykuÅÃ³w