Voolutsütomeetriat kasutatakse valdavalt meditsiinis haigustekitajate ja rakutsükli
uurimiseks. Seene eoste ja genoomi suuruse mõõtmiseks on varem kasutatud
valgusmikroskoopiat. Eose suurus on oluline tunnus seente süstemaatikas, mida
kasutatakse nii liikide piiritlemisel kui liikide määramisel (Parmasto E. ja Parmasto I.
1987). Genoomi suurus, tuuma DNA sisaldus ja polüploidsus on olulised parameetrid
seente elurikkuse uurimisel.
Uuringu eesmärk oli rakendada voolutsütomeetriat taelikute (Phellinus) ja servikute
(Pleurotus) liikidel eose ja genoomi suuruse määramisel. Töötati välja uus metoodika
ellipsoidsete seeneeoste mõõtmiseks. Eostest genoomis suuruse määramiseks lahendati
mitmeid probleeme. Töötati välja uus metoodika eostest tuumade väljutamiseks sest
selgus, et genoomi suurust eoste tugeva autofluoresentsi tõttu paksukestaliste eoste
tuumadest mõõta ei saa. Seevastu selgus, et eoseid ja tuumi on lihtne grupeerida tänu
autofluorestentsi olemasolule nende suuruse mõõtmiseks. Eose autofluoresentsi
intensiivsus ise aga uue tunnusena võimaldab koos eose suurusega kasutades eritada
gruppe, mis ainult eose pikkuse ja laiuse järgi ei eritu.
Töö käigus eraldati intaktsed tuumad liikidel austerservik (Pleurotus ostreatus) ja
kopsservik (P. pulmonarius). Uuringu käigus mõõdeti 136 seene eoste suurused ning 16
seene genoomi suurus. Tuuma suuruse ja DNA-sisalduse vahel on seos
korrelatsioonikordajaga 0,75. Intaktsete tuumade mõõtmine väldib eoste
autofluorestsentsist ja eosproovis mingi osa mitmiktuumadega eoste olemasolust tekkida
võivat tegelikust suurema genoomi saamist. Genoomi suuruste suhteliseks määramiseks
kasutati referentorganismi austerservik (Pleorotus ostreatus) TAAM126992 (genoomi
suurusega 32 Mbp) kasutades selleks rakutsükli faasis G1 olevaid tuumi.
Uuringu käigus välja töötatud läbivoolutsütomeetria metoodeid on võimalik kasutada
seente süstemaatika jaoks eoste ja genoomi suuruse järgi liikide grupeerimiseks, liikide
piiritlemiseks ja määramiseks. Voolutsütomeetria võimaldab kiiresti saada täpseid andmeid
eosproovis olevate eoste mitmete parameetrite varieeruvuse kohta. Kasutades etalone saab
suhtelistesed mõõdud konverteerida absoluutseteks ja teiste meetoditega saadud andmetega
koos kasutadaFlow cytometry is mainly used in medicine to study pathogens and cell cycles. Fungal
spore size is one of the most important characteristics in fungal taxonomy when studying
species delimitation or determining species (Parmasto E. and Parmasto I. 1987).
Previously, fungal spore and genome sizes were usually measured using light microscopy.
Genome size, nuclear DNA content, and polyploidy are important if exploring fungal
diversity.
The aim of this study was to implement flow cytometry to measure spore and genome sizes
of selected fungal groups of genus Phellinus and Pleurotus. A new methods for measuring
elliptical spore sizes was developed for this. Due to strong autofluorescence of spores
genome size was hard to measure for thick-walled spores and a new way to excrete nuclei
of spores was therefore developed. In contrast, autofluorescence allowed for an easier way
select groups of spore for further measuring. Using spore sizes and intensity of
autofluorescence measured by flow cytometry allows for grouping specimen where
differentiation based on spore length and width is difficult.
Intact nuclei were isolated from Pleurotus ostreatus and P. pulmonarius spores. During
this study, spores of 136 fungi and genome sizes of 16 fungi were measured. Correlation
coefficient between DNA content and volume of the nucleus was 0,75. Measuring only
intact single nucleus of spore excludes possibility to make mistakes by measuring two
nuclei as one. To determine genome size reference organism (Pleorotus ostreatus)
TAAM126992 (genome size 32 Mbp) cell cycle G1 phase spores were used.
The study provides new methods for flow cytometry to measure spores size of elliptical
spores and obtain intact nuclei for measure their DNA content. Using flow cytometry,
large amounts of spores could be measured in minutes and using random sampling. Using
two parameter analysis of spore sizes and intensity of autofluorescence reveal groups for
fungal taxonomy to identify and delimit species
