Role of autophagy in liver sinusoidal endothelial cells on nonalcoholic steatohepatitis

Abstract

Contexte et hypothèse : La stéatohépatite non alcoolique (NASH) est définie par une accumulation excessive de lipides dans le foie (stéatose), une atteinte hépatocytaire et une inflammation hépatique avec ou sans fibrose. La NASH peut évoluer vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. De récentes études suggèrent que des altérations microvasculaires et une dysfonction endothéliale sinusoïdale précèdent l'atteinte fibreuse et inflammatoire de la NASH. L'autophagie est un processus cellulaire par lequel du matériel cytoplasmique rejoint les lysosomes pour dégradation. L'autophagie a été étudiée dans les différents types cellulaires du foie, mais le rôle de l'autophagie dans les cellules endothéliales sinusoïdales du foie (LSECs) n'a à ce jour jamais été évalué dans la NASH. Le but de mon projet de thèse a été d'évaluer le rôle de l'autophagie dans les LSECs dans la NASH. Matériel et méthodes : (a) échantillons humains : j'ai utilisé des biopsies hépatiques humaines de patients avec un foie histologiquement normal, de patients atteints de stéatose ou de patients atteints de NASH, afin d'évaluer par microscopie électronique l'autophagie dans les LSECs. (b) LSECs en culture : j'ai testé l'effet du TNFa et de l'IL6, aux concentrations rapportées dans le sang portal d'individus atteints de syndrome métabolique, sur l'autophagie dans une lignée de LSECs soumises à des contraintes de cisaillement. Enfin, j'ai caractérisé l'effet du défaut d'autophagie sur le phénotype endothélial en utilisant une lignée de LSECs que j'ai transduites avec un shARN ciblant ATG5 pour les rendre déficientes en autophagie. (c) souris transgéniques : J'ai évalué l'effet du défaut d'autophagie endothéliale sur les stades précoces de la NASH, en utilisant une ligné de souris déficientes en autophagie spécifiquement dans l'endothélium (Atg5lox/lox VE-cadhérine-Cre) soumises à un régime riche en matières grasses pendant 16 semaines, et sur les stades avancés de la fibrose hépatique en traitant les souris Atg5lox/lox VE-cadhérine-Cre au tétrachlorure de carbone (CCl4). Résultats : (a) échantillons humains : Le pourcentage de LSECs contenant des vacuoles d'autophagie était 2 fois moins important dans le foie des patients atteints de NASH comparativement aux témoins et aux patients atteints de stéatose. (b) LSECs en culture : La combinaison de TNFa et d'IL6 réduisait significativement l'autophagie dans les LSECs. Cette réduction passait par l'inhibition de l'AMPKa. Les LSECs déficientes en autophagie surexprimaient les gènes inflammatoires Mcp1 et Rantes et la protéine VCAM1. Le défaut d'autophagie dans les LSECs induisait une surexpression des marqueurs de transition endothélio-mésenchymateuse a-SMA, Collagène1a1, Collagène1a2 et Tgf-b1. (c) souris transgéniques : Comparativement aux souris contrôles, les souris Atg5lox/lox VE-cadhérine-Cre avaient une inflammation hépatique augmentée (surexpression hépatique des gènes inflammatoires Mcp1 et Rantes et de la protéine VCAM1). La déficience en autophagie endothéliale augmentait la fibrose (surexpression hépatique des gènes fibrogéniques Collagène1a2 et Tgf-b1, de la protéine a-SMA et de la surface de collagène). Les souris Atg5lox/lox VE-cadhérine-Cre traitées au CCl4 présentaient plus de fibrose que les souris contrôles soumises au même traitement (surexpression hépatique des gènes fibrogéniques a-SMA, Collagène 1a1, Collagène 1a2 et Tgf-b1, augmentation de la surface de collagène). Conclusion : Un défaut d'autophagie dans les LSECs se produit chez les patients atteints de NASH. Le TNFa et l'IL6 présents dans le sang portal de ces patients pourraient être responsables de ce défaut en altérant l'activité de l'AMPKa. Le défaut d'autophagie dans les LSECs favorise le développement de l'inflammation et de la fibrose hépatique aux stades précoces et avancées de la maladie. Cibler l'autophagie dans les LSECs constitue une stratégie thérapeutique intéressante pour le traitement de la NASH.Background and Aims: Non alcoholic steatohepatitis (NASH) is defined as the excessive lipids accumulation in the liver, hepatocellular injury and inflammation with or without fibrosis. NASH has the potential for cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Recent studies suggest that microvascular alterations and sinusoidal endothelial dysfunction precede inflammation and fibrosis in NASH. Autophagy is a cellular process by which the dysfunctional cytoplasmic material joins lysosomes for degradation. The role of autophagy in hepatocytes, in hepatic stellate cells and in liver monocyte-macrophages has been studied but nothing is known about the role of autophagy in liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) in NASH. The aim of my thesis work was to investigate the potential implication of autophagy in LSECs in NASH and liver fibrosis. Method: (a) Human samples: I used liver biopsies from patient without liver histological abnormalities, with simple steatosis or with NASH to analyze autophagy in LSECs by electron microscopy. (b) Cultured LSECs: I tested the effect of TNFa and IL6 (at concentrations present in the portal venous blood of patients with metabolic syndrome) on autophagy in LSECs exposed to shear stress. I characterized the effect of autophagy deficiency on the phenotype of LSECs by transducing transformed LSECs with a shRNA targeting ATG5. (c) Transgenic mice: I analyzed the effect of a defect in endothelial autophagy on early stages of NASH, by using mice deficient in autophagy specifically in endothelial cells (Atg5lox/lox-VE-CadherinCre), fed a high fat diet (HFD) for 16 weeks, and on advanced stages of liver fibrosis by treating Atg5lox/lox-VE-CadherinCre mice with carbon tetrachloride (CCl4). Results: (a) Human samples: Patients with NASH had twice less LSECs containing autophagic vacuoles than patients without liver histological abnormalities or patients with simple steatosis. (b) Cultured LSECs: The combination of TNFa and IL6 decreased autophagy level in LSECs. This reduction of autophagy involved the inhibition of AMPKa. LSECs deficient in autophagy overexpressed Mcp1 and Rantes genes and VCAM1 protein expression. Deficiency in autophagy in LSECs induced the expression of the endothelial to mesenchymal transition markers a-SMA, Collagen1a1, Collagen1a2 and Tgf-b1. (c) Transgenic mice: As compared to littermate controls, mice deficient in endothelial ATG5 fed a HFD had a more frequent nodular liver surface, a higher liver inflammation (increased liver gene expression of Mcp-1 and Rantes and VCAM1 protein) and more liver fibrosis (increased liver gene expression of Collagen1a2 and Tgf-b1, higher expression a-SMA protein and more collagen deposition). Mice deficient in ATG5 in endothelial cells treated with CCl4 had more liver fibrosis (increased liver gene expression of a-SMA, Collagen1a1, Collagen 1a2 and Tgf-b1 and more collagen deposition). Conclusion: Autophagy is defective in LSECs of patients with NASH. TNFa and IL6 at concentrations present in the portal blood of patients with NASH could be responsible for this defect through the impairment of AMPKa activity. Autophagy defect in LSECs contributes to the development of liver inflammation and fibrosis at early and advanced stages of the disease. Stimulating endothelial autophagy could be an attractive strategy for NASH treatment