Quantitative (phospho)-proteomics identifies a novel role for hedgehog in reprogramming adipocyte energy metabolism

Abstract

Zsfassung in dt. SpracheDer Hedgehog Signaltransduktionsweg (Hh) spielt eine essentielle Rolle in Entwicklungsprozessen von der Fruchtfliege bis hin zum Mensch.Eine unzureichende Funktion des Hh führt zu schweren Missbildungen, wobei eine Überreaktion mit Tumorentstehung in Verbindung steht.Daten unserer Forschungsarbeiten bestätigten (i) eine Schlüsselfunktion des Hh in der Inhibierung der Differenzierung weißer, aber nicht brauner Fettzellen sowohl in vitro als auch in vivo und, (ii) dass diese hemmende Wirkung durch das T-Zellen Zytokin Interferon-gamma blockiert wird. Interessanterweise hat sich bis dato keine Studie damit befasst, den Hh auf reife Fettzellen zu untersuchen und keine (phospho)-proteomischen Daten sind vorhanden. Somit setzten wir uns das Ziel, neue Mechanismen des Hh auf reife Fettzellen, mit Hilfe quantitativer proteomischer Methoden zu erfassen.2D-PAGE und 1D-GeLC/MSMS mit (i) angereicherten Phosphoproteinen und (ii) der zytoplasmatischen Fraktion reifer Adipozyten wurde angewandt.Ziel war es, Änderungen in (De)-Phosphorylierungen beziehungsweise des Expressionsmusters in Hedgehog stimulierten Fettzellen zu detektieren.Western blot Analysen, sowie ELISA Messungen untermauerten diese Ergebnisse.Phosphoprotein-spezifische 1D- und 2D-Gele identifizierten eine hoch reproduzierbare Phosphorylierung der Pyruvate Dehydrogenase (PDH) E1 alpha in Hedgehog stimulierten Adipozyten. Passend dazu war die zugehörige PDH Kinase überexpremiert in der cytoplasmatischen Fraktion reifer Fettzellen anzutreffen. Die glykolytischen Schlüsselenzyme Phosphofructokinase und Pyruvat Kinase M2 waren ebenfalls signifikant verändert in Hedgehog behandelten Proben. Diese Änderungen zeigten einen Glukosefluss in Richtung erhöhter Laktatproduktion. Detailuntersuchungen bestätigten Änderungen der Glykolyse und der mitochondrialen Funktion und zeigten auch erhöhte NAD+/NADH und NADP+/NADPH Ratios.Schlussendlich ermittelten diese (phospho)-proteomischen Daten Hh als einen unbekannten Regulator des Energiestoffwechsels, der zu einem erhöhten Glucosedurchsatz und Laktatproduktion führt.Hedgehog (Hh) signaling plays a fundamental role in developmental processes conserved from flies to humans, whereas aberrant Hh reactivation has been linked to cancer. Data from our laboratory identified (i) a key role for Hh in inhibiting white but not brown adipocyte differentiation in vitro and in vivo, and (ii) that this inhibitory Hh effect on white fat cell differentiation can be blocked by the activated T-cell cytokine interferon-gamma. However, no studies have so far addressed the impact of Hh on mature adipocytes and no data at all are available on Hh induced (phospho)-proteomic changes. Therefore, we set out to address both aspects and made use of quantitative proteomic approaches to identify new Hh targets and mechanisms in mature adipocytes.We performed 2D-PAGE and 1D-GeLC/MSMS with (i) phospho-protein enriched samples and (ii) cytoplasmic fractions to gain unbiased insight into rapid phosphorylation and lasting expression changes, respectively.Western blots and ELISA were performed to validate results. Phospho-protein-specific 1D- and 2D-gels revealed a highly reproducible phosphorylation of pyruvate dehydrogenase (PDH) E1 alpha in Hh treated samples. In line with this data we observed a significant up-regulation of PDH-kinase in the cytoplasmic fraction. Furthermore, the glycolytic key enzymes phosphofructokinase and pyruvate kinase M2 were significantly altered in Hh treated samples, leading to a shift towards lactate production. Pathway analyses identified major changes in glycolysis and mitochondrial function. Of note, increased NAD+/NADH and NADP+/NADPH ratios further reflected Hh induced metabolic reprogramming. In summary, our unbiased (phospho)-proteomic screen identified Hh as a hitherto unknown regulator of cellular energy metabolism, leading to increased glucose turnover and lactate production.<br /