Probing lipid interactions of plasma membrane proteins: a micropatterning approach

Abstract

Lipide und Proteine sind keine unabhängigen Bestandteile der Plasmamembran von eukaryotischen Zellen. Vielmehr beeinflussen sie sich gegenseitig in ihrer Anordnung, Dynamik und Funktion. Trotz umfangreicher Studien in den vergangenen Jahrzehnten bleiben viele Fragen zu den fundamentalen Mechanismen, die ihre Interaktion bestimmen, unbeantwortet. In dieser Studie wurde ein Micropatterning Assay optimiert und mit Einzelmolekül-Tracking von verschiedenen Lipiden kombiniert. Dies erlaubte die direkte Messung von Lipid-Protein-Interaktionen in der Plasmamembran lebender Zellen. Für unsere Untersuchungen haben wir zwei Proteine aus verschiedenen Familien ausgewählt: i) CD59, ein Protein, das an der Zellaußenseite der Plasmamembran über einen Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-anker gebunden ist und ii) ein palmitoyliertes Transmembranprotein. Während die Modifikation hydrophiler Proteine durch Fettsäuren ihrer Verankerung in der Plasmamembran dient, ist die Funktion der Palmitoylierung für Transmembranproteine noch weitgehend unklar. Eine Hypothese besagt, dass beide posttranslationalen Modifikationen, GPI-Verankerung und Palmitoylierung, die Präferenz von Proteinen für geordnete Membranphasen erhöhen. Ob solche Phasen in lebenden Zellen überhaupt existieren, ist nach wie vor sehr umstritten. In dem hier vorgestellten experimentellen Ansatz wurden die zu untersuchenden Proteine mit Fluorophoren markiert und in definierten Bereichen in der Plasmamembran angereichert. Anschließend wurde die Verteilung und das Diffusionsverhalten von Lipiden und Proteinen in den so generierten Regionen untersucht. Daraus konnten Rückschlüsse auf Lipid-Protein-Wechselwirkungen sowie die lokale Membranumgebung der Proteine gezogen werden. Es zeigte sich, das die Membranviskosität in den mit den ausgewählten Proteinen angereicherten Bereichen unverändert blieb. Die Diffusion der markierten Lipide wurde nur durch sterische Einflüsse der immobilisierten Proteinen beeinflusst. Lipid-spezifische Interaktionen mit Proteinen wurden nicht beobachtet. Experimente mit verschiedenen fluoreszenzmarkierten Lipiden, sowie Cholesterinextraktion, erlaubten weiters, die Bildung von geordneteren Membrandomänen in der Umgebung der Proteine auszuschließen.It is well established that lipids and proteins are not just independent components of the plasma membrane of eukaryotic cells, but that their arrangement, dynamics and function are interdependent. Despite extensive research in the past decades, many questions as to the fundamental underlying mechanisms of how, when and why these species interact with each other, have remained unanswered. In this study, we optimized and used a protein micropatterning assay, and combined it with single-molecule tracking of lipid probes to directly measure lipid-protein interactions in the plasma membrane of living cells. For our studies, we have selected two proteins of interest (POIs) from different families: i) CD59, a protein anchored to the outer leaflet of the plasma membrane via a glycosylphosphatidylinositol(GPI)-anchor, and ii) a truncated version of the palmitoylated transmembrane protein, hemagglutinin (HA). While attachment of fatty acids to soluble proteins clearly serves to facilitate their association with the plasma membrane, the role of palmitoylation for transmembrane proteins is less clear. Both posttranslational modifications, GPI-anchorage and palmitoylation, have been suggested to direct the partitioning of proteins to ordered membrane phases. Whether such phases exist in living cells, however, is still highly debated. In our experimental approach, fluorescently labelled POIs were captured and enriched within well-defined areas in the human plasma membrane, leaving regions depleted of POI, which served as reference areas. From the distribution and diffusion behaviour of lipids and proteins with respect to the POI patterns, we were able to probe lipid-protein interactions as well as the local membrane environment of the POI. We found that the viscosity of the membrane within POI-enriched areas was unchanged. Our lipid probes only experienced steric hindrance by the protein functioning as an obstacle to their diffusion. Moreover, we did not observe any lipid specific lipid-protein interactions. Experiments using different fluorescently labelled lipids as well as cholesterol depletion allowed us to rule out formation of more ordered membrane domains around the proteins.13