A new way of deblocking of synthetic hexachlorofluorescein-oligodeoxyribonucleotides (HEX-ODN) prevents the modification of the label and the accumulation of difficult to separated by-product. It was shown that this method increases the efficiency of purification HEX-ON and the sensitivity of DNA diagnostics.Новый способ деблокирования синтетических гексахлорфлуоресцеин-олигодезоксирибонук-леотидов (HEX-ODN) препятствует модификации метки и накоплению трудно отделяемого побочного продукта. Показано, что его применение увеличивает эффективность очистки HEX-ODN и чувствительность ДНК-диагностики

A. Chuvilin N.

A. Mosina G.

G. Pozmogova E.

I. Smirnov P.

V. Travkin F.

А. Мосина Г.

А. Чувилин Н.

В. Травкин Ф.

Г. Позмогова Е.

И. Смирнов П.

Russian

A. G. Mosina

A. N. Chuvilin

I. P. Smirnov

V. F. Travkin

G. E. Pozmogova

А. Г. Мосина

А. Н. Чувилин

И. П. Смирнов

В. Ф. Травкин

Г. Е. Позмогова

Fine Chemical Technologies (E-Journal) / Тонкие химические технологии

Вестник МИТХТ, 2012, т. 7, № 4  72  ХИМИЯ И ТЕХНОЛОГИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ-АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ УДК 57.088.3:543.544.52, 577.113.6, 577.113.083 АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ ОЧИСТКИ hex-ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДИФИЦИРОВАННОГО МЕТОДА ДЕБЛОКИРОВАНИЯ А.Г. Мосина, аспирант, *А.Н. Чувилин, старший научный сотрудник,  *И.П. Смирнов, старший научный сотрудник, В.Ф. Травкин, профессор, *Г.Е. Позмогова, профессор кафедра Аналитической химии им. И.П. Алимарина МИТХТ им. М.В. Ломоносова *Научно-исследовательский институт физико-химической медицины  Федерального медико-биологического агентства России  е-mail: AlenaGMosina@yandex.ru   овый способ деблокирования синтетических гексахлорфлуоресцеин-олигодезоксирибонук-леотидов (HEX-ODN) препятствует модификации метки и накоплению трудно отделяемого побочного продукта. Показано, что его применение увеличивает эффективность очистки HEX-ODN и чувствительность ДНК-диагностики. A new way of deblocking of synthetic hexachlorofluorescein-oligodeoxyribonucleotides (HEX-ODN) prevents the modification of the label and the accumulation of difficult to separated by-product. It was shown that this method increases the efficiency of purification HEX-ON and the sensitivity of DNA diagnostics. Ключевые слова: гексахлорфлуоресцеин, олигодезоксирибонуклеотиды, ВЭЖХ, ПЦР в режиме ре-ального времени. Key words hexachlorofluorescein lаbel, oligodeoxyribonucleotides, HPLC, real time PCR.  Введение Прогресс в области разработки и внедрения медицинских микроаналитических методов ди-агностики, например, в генодиагностике, в зна-чительной мере обусловлен использованием олигодезоксирибонуклеотидов (ODN), снабжен-ных флуоресцентными метками [1, 2]. Сов-ременные методы ДНК-анализа, в частности, полимеразная цепная реакция в реальном масш-табе времени (РВ-ПЦР), подразумевает исполь-зование синтетических ODN-зондов. Зонд изби-рателен к определенному участку целевой ДНК и снабжен одновременно флуоресцентной мет-кой и гасителем флуоресценции так, что и в свободном состоянии, и в комплексе с ДНК флуоресценция погашена. В процессе ПЦР происходит расщепление зонда, а регистриру-емый сигнал флуоресценции возрастает в зависимости от исходного содержания мишени. Использование нескольких зондов с различ-ными флуорофорами в условиях одного опыта (мультиплексная ПЦР) позволяет провести ко-личественный анализ содержания различных ДНК, например, нескольких патогенов. Чувст-вительность и достоверность метода РВ-ПЦР во многом определяется качеством и надежностью работы зондов [3]. Гексахлорфлуоресцеиновая метка (HEX) широко используется в ПЦР-диагностике, в осо-бенности, в мультиплексных вариантах [4]. Ра-нее нами было показано, что все ODN, несущие HEX-метку, содержат 20-30% примеси, облада-ющей искаженными флуоресцентными свойст-вами (λem 516±2 нм, а чистые НЕХ-производные имели λem 553±1 нм). Мы обнаружили, что в структуре HEX гетероциклический кислород замещается в процессе постсинтетического ам-монолиза на азот с образованием акридинового (ACR-) производного (рис. 1) [5] и предложили удалять побочный продукт с помощью обра-щенно-фазовой высокоэффективной жидкост-ной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ).    Рис. 1. Схема трансформации HEX-меченых олигонуклеотидов в акридиновые (ACR) производные (R – олигонуклеотид).  С помощью УФ-сканирования было уста-новлено, что в ряде случаев удаление ACR-производного с помощью ВЭЖХ и электро-фореза в ПААГ не было эффективным. Нами предложен модифицированный способ де-блокирования, основанный на использовании смесей аммиака с аминами, несущими разветвленный алифатический остаток. Задача настоящей работы состояла в ана-лизе эффективности применения ОФ-ВЭЖХ и электрофоретического разделения в ПААГ для очистки HEX-олигонуклеотидов, полу-Н Вестник МИТХТ, 2012, т. 7, № 4 73  ченных с использованием нового метода деблокирования. Результаты и их обсуждение Для того чтобы провести анализ эффективнос-ти применения ОФ-ВЭЖХ для очистки HEX-олиго-нуклеотидов, было синтезировано три ДНК-зонда, несущих 5’-метку HEX и 3’-гаситель флуорес-ценции BHQ2 (Black hole quencher, 4'-(4-нитро-4-фенилдиазо)-2'-метокси-5'-метил-азобензол-4''-(N-этил)-N-этил-2-циано-этил-(N,N-диизопро-пил)) (таблица). Часть реакционной смеси обра-батывали концентрированным водным раство-ром аммиака (стандартный способ), а часть – смесью водного раствора аммиака с 20–25% трет.-бутиламина (модифицированный спо-соб). На рис. 2 приведены хроматограммы трех зондов, полученных с использованием разных способов деблокирования. Видно, что ВЭЖХ-очистка НЕХ-ODN, которая проходила в гради-енте ацетонитрила в 0.1 M ацетате аммония, pH 6.7, при 40–50ºC, позволяет полностью отделить акридиновую примесь (рис. 2 а, б, I). Однако некоторые HEX-производные не удается эффективно разделить в данных условиях, например, такие как НВ28 (рис. 2 в, I), что подт-верждается УФ-спектрами 3 и 4 (рис. 2). Новый способ деблокирования HEX-ODN минимизи-рует содержание ACR-производных и сущест-венно упрощает хроматографическую очистку. Так, на приведенных хроматограммах НЕХ-зондам соответствуют индивидуальные пики 2 (рис. 2 a–в, II). Формулы и условия ВЭЖХ-выделения олигодезоксирибонуклеотидов Условия ВЭЖХ Название Формула Градиент MeCN Температура, ºC HB37 5'-HEX-d(A7C12G12T6) -3'-BHQ2 30–55% / 25 мин 50 HB38 5'-HEX-d(A4C17G9T8)-3'-BHQ2 12–20% / 25 мин 42 HB28 5'-HEX-d(A9C5G5T9)-3'-BHQ2 25–32.5% / 20 мин 45  Безусловным преимуществом нового метода деблокирования является то, что он позволяет получать зонды, свободные от ACR-примесей, с помощью стандартного электрофоретического раз-деления в ПААГ, что особенно важно при прове-дении скрининговых исследований. Рисунок 3 на примере флуоресцентных кривых кинетики на-копления продуктов амплификации ДНК (из клинического образца урогенитального соскоба эпителиальных клеток) в процессе РВ-ПЦР ил-люстрирует значительное увеличение чувстви-тельности флуоресцентного анализа при ис-пользовании зонда HB38 (кривая накопления 1), полученного новым способом (рис. 3А). Важно отметить, что этот эффект опосредован только качеством зонда, а не количественным содержа-нием в пробе амплифицированной ДНК (рис. 3Б).  Таким образом, исследования процесса де-блокирования HEX-олигонуклеотидов позволи-ли найти условия, предотвращающие образо-вание примеси. Применение этого метода дало возможность значительно упростить очистку HEX-зондов и в результате получать досто-верные результаты при работе в области высокой чувствительности метода ПЦР с детекцией в реальном масштабе времени.                              а) б)               в) Рис. 2. УФ-спектры и хроматограммы НЕХ-олигонуклеотидов (0.2 мкмоль) HB37 (а), HB38 (б) и HB28 (в) после стандартного аммонолиза (I) и после использования нового метода деблокирования (II).  УФ-спектры: 1 – ACR-производное; 2 – HEX-ODN; 3 – 20% ACR-производного НВ28;  4 – 50% ACR-производного НВ28. mAU – оптические единицы УФ-поглощения при 260 нм. Вестник МИТХТ, 2012, т. 7, № 4  74    Рис. 3. Кривые кинетики накопления продуктов амплификации ДНК (из клинического образца урогенитального соскоба эпителиальных клеток) в процессе РВ-ПЦР (А) и электрофоретический  анализ (2% агароза, бромистый этидий) их результирующего содержания (Б).  Данные получены с использованием набора Флуоропол-Chl.tr ЕР (ООО «НПФ Литех», Россия),  содержащего зонд HB38, очищенный в стандартных условиях электрофореза в ПААГ.  1 – при получении зонда использовался модифицированный метод деблокирования;  2 – при получении зонда использовался стандартный аммонолиз.  Экспериментальная часть ODN-зонды синтезировали твердофазным амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ДНК АСМ 800 («Биоссет», Россия) с использованием стандартных коммерческих реагентов (все реактивы Glen Research, США). После завершения синтеза носитель с меченым ODN выдерживали 24 ч при комнатной темпе-ратуре в концентрированном водном растворе аммиака (стандартный метод) или его смесью с 20–25% трет.-бутиламина (модифицирован-ный метод). Формулы и условия выделения олигодезоксирибонуклеотидов перечислены в таблице. ВЭЖХ проводили на хроматографе Agilent Chemstation 1100 Series, колонка Macherey-Nagel Nucleosil 300 С18, 4.6×250 мм. НЕХ-зонды выде-ляли в градиенте ацетонитрила в 0.1 М водном растворе ацетата аммония. Детектирование олигонуклеотидов, снабженных полиненасы-щенными заместителями, проводилось при длине волны максимума поглощения 260 нм (Agilent UV-VIS matrix 45 detector G1315B).  ПЦР-анализ осуществляли на приборе iCycler iQ5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Амплификационные смеси объемом 20 мкл составлялись на основе 10× буфера (0.5 М Tris, 0.5M KCl, 30 мМ MgCl2), 1000 мкМ каждого из dNTP, по 200 нМ каждого из ПЦР-праймеров, 100 нМ зонда и 10 ед. Taq-полимеразы (ООО «НПФ Литех», Россия). К реакционной смеси добавляли 5 мкл анализируемого образца. ПЦР начинали с предварительной денатурации при 94оС (90 с) и далее проводили 40 циклов по программе: 94оС (10 с), 64оС (10 с), 72оС (40 с), 50оС (считывание флуоресцентного сигнала).  ЛИТЕРАТУРА: 1. Yeung A.T., Holloway B.P., Adams P.S. Evaluation of dual-labeled fluorescent DNA probe purity versus performance in real-time PCR // Biotechniques. 2004. V. 36. P. 266–270. 2. Wilkening S., Bader A. Quantitative real-time polymerase chain reaction: Methodical analysis and mathematical model // J. Biomol. Tech. 2004. V. 15. P. 107–111. 3. Juskowiak B. Nucleic acid-based fluorescent probes and their analytical potential // Anal. Bioanal. Chem. 2011. V. 399. P. 3157–3176. 4. Marras S.A., Tyagi S., Kramer F.R. Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes // Clin. Chim. Acta. 2006. V. 363. P. 48–60. 5. Chuvilin A.N., Serebryakova M.V., Smirnov I.P., Pozmogova G.E. Byproduct with altered fluorescent properties is formed during standard deprotection step of hexachlorofluorescein labeled oligonucleotides // Bioconjugate Chem. 2009. V. 20. P 1441–1443.   

Анализ эффективности очистки HEX-олигонуклеотидов, полученных с использованием модифицированного метода деблокирования

https://www.finechem-mirea.ru/jour/article/download/719/765

Анализ эффективности очистки HEX-олигонуклеотидов, полученных с использованием модифицированного метода деблокирования

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Fine Chemical Technologies (E-Journal) / Тонкие химические технологии