Estudio de los mecanismos fisiológicos y moleculares implicados en la formación y desarrollo de las raíces adventicias en distintas especies vegetales

Abstract

The adventitious root formation is critical for the plant survival during its vegetative propagation through cuttings, hence the study and understanding of this process is strategic during mass propagation of the new elite varieties obtained by genetic breeding. This Thesis pursues genetic, morphological and hormonal studies of de novo root formation in the Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. model, and in two other plant species of agronomic interest in the Mediterranean region, such as the cultivated carnation (Dianthus caryophyllus L.) and the argan tree (Argania spinosa [L.] Skeels). To identify some genetic determinants involved in woundinduced root formation process, we carried out a genomewide association (GWA) study in a collection of 174 Arabidopsis thaliana natural accessions. We found statistically significant associations between woundinduced root system architectural traits and 19 genomic loci. We then studied three candidate loci associated with woundinduced lateral root formation. Lossoffunction mutants in one of these genes, At4g01090, which encodes a protein of unknown function, were affected in woundinduced lateral root development. We identified null alleles in the At5g19710 gene, which encodes a histidine phosphotransfer protein putatively involved in cytokinin signalling, with a reduced number of lateral roots after root tip excision. In addition, we found an epistatic interaction between several nonsynonymous single nucleotide polymorphisms in the coding region of K+ UPTAKE TRANSPORTER 5 (KUP5), which encodes a potassium uptake transporter; and At5g19710, which would point to a functional relationship between both processes and woundinduced root formation. We studied morphological changes occurring in the basal region of stem cuttings during rooting in a collection of 159 F1 lines derived from a cross between two carnation hybrid cultivars, 210102 MFR and 2003 R 8, with contrasting rooting performances. We provided molecular evidence that the badrooting behaviour of 2003 R 8 cuttings was caused by an early inactivation of active auxin, indole3acetic acid, through its conjugation with aspartic acid by GRETCHEN HAGEN 3 proteins. Our analyses further elucidated the relationship between the physiological state of carnation cuttings, estimated by the proportion of salicylic acid and jasmonate, and the formation of adventitious roots. In addition, we developed an effective method for argan micropropagation from in vitro germinated seeds and we considerably increased the adventitious rooting from lignified cuttings obtained from adult plants. When combined with a suitable genetic selection, our procedure will allow the efficient production of elite varieties of argan trees for intensive cultivation.La formación de raíces adventicias supone un paso crítico y de vital importancia para la supervivencia de las plantas que se propagan vegetativamente mediante esquejes, por lo que el estudio y la comprensión de este proceso es clave para optimizar la propagación vegetativa de las nuevas variedades élite obtenidas por métodos convencionales de mejora genética. En esta Tesis se propone el estudio a nivel genético, morfológico y hormonal de la formación de raíces de novo en la crucífera modelo Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., y en dos especies de interés agronómico en la región mediterránea: el clavel cultivado (Dianthus caryophyllus L.) y el argán (Argania spinosa [L.] Skeels). Para identificar algunos de los determinantes genéticos implicados en la formación de raíces en respuesta a herida, hemos llevado a cabo un estudio de asociación a genoma completo o GWA (genomewide association study) en una colección de 174 estirpes silvestres de Arabidopsis thaliana. Nuestros resultados indican que existen asociaciones estadísticamente significativas entre los cambios en la arquitectura radicular en respuesta a herida y 19 regiones genómicas concretas. Nos hemos centrado en el análisis genético de 6 polimorfismos de un solo nucleótido o SNPs (single nucleotide polymorphisms) que generan cambios no conservados de residuos aminoacídicos en la región codificante de tres genes. Los mutantes de pérdida de función en At4g01090, que codifica una proteína de función desconocida, muestran un menor número de raíces laterales en respuesta a herida. Hemos identificado alelos nulos en el gen At5g19710, que codifica una proteína con un dominio de histidina para la fosfotransferencia implicado en la señalización de las citoquininas, con un número reducido de raíces laterales en respuesta a herida. Además, hemos encontrado una interacción epistática entre los SNPs de la región codificante de K+ UPTAKE TRANSPORTER 5 (KUP5), cuyo producto participa en la asimilación del potasio, y At5g19710, lo que apuntaría a una relación funcional entre ambos procesos y con la formación de raíces en respuesta a herida. Por otra parte, hemos llevado a cabo un análisis detallado de la formación de raíces adventicias a partir de esquejes de clavel cultivado en una colección de 159 líneas F1 derivadas del cruzamiento entre dos variedades comerciales, 210102 MFR y 2003 R 8, que difieren de forma significativa en su capacidad de enraizamiento adventicio. Hemos proporcionado evidencias moleculares de que la baja capacidad de enraizamiento adventicio de los esquejes en la estirpe 2003 R 8 se debe a una inactivación temprana de la auxina activa, el ácido indolacético, en la base del esqueje mediante su conjugación con ácido aspártico por enzimas de la familia GRETCHEN HAGEN 3. Nuestros análisis han permitido dilucidar, además, la relación existente entre el estado fisiológico de los esquejes de clavel, estimada por la proporción de ácidos salicílico y jasmónico, y la formación de raíces adventicias. Adicionalmente, hemos desarrollado un método eficaz para la micropropagación del argán a partir de semillas germinadas in vitro, además de un protocolo que ha permitido incrementar considerablemente la formación de raíces adventicias a partir de esquejes lignificados obtenidos de plantas adultas. Combinado con una selección genética adecuada, nuestro procedimiento permitirá la producción eficiente de variedades élite de argán para su uso en cultivo intensivo