In questo lavoro vengono presentati i risultati preliminari del progetto “Steady Wine”. Vini bianchi proteicamente instabili sono stati stabilizzati con impiego di materiali ceramici in un sistema a flusso. Il dispositivo filtrante ha dimostrato selettività nella rimozione delle proteine e una efficace prevenzione della instabilità proteica, senza influire sui parametri chimici del vino

Giuseppina Parpinello, Arianna Riicci, Marina Serantoni, Andrea Balducci, Luigi Ragni, Andrea Versari,

In questo lavoro vengono presentati i risultati preliminari del progetto “Steady Wine”. Vini bianchi proteicamente instabili sono stati stabilizzati con impiego di materiali ceramici in un sistema a flusso. Il dispositivo filtrante ha dimostrato selettività nella rimozione delle proteine e una efficace prevenzione della instabilità proteica, senza influire sui parametri chimici del vino

Giuseppina Parpinello

Arianna Riicci

Marina Serantoni

Andrea Balducci

Luigi Ragni

Andrea Versari

Archivio istituzionale della ricerca - Alma Mater Studiorum Università di Bologna

MENSILE DELL’ASSOCIAZIONE ENOLOGI ENOTECNICI ITALIANI. ORGANIZZAZIONE NAZIONALE DI CATEGORIA DEI TECNICI DEL SETTORE VITIVINICOLO - N° 12 DICEMBRE 20192 0 1 2 1  M I L A N O  -  V I A  P R I V A T A  V A S T O ,  3  -  T E L  0 2 . 9 9 7 8 5 7 2 1  -  F A X  0 2 . 9 9 7 8 5 7 2 4  -  P O S T E  I T A L I A N E  -  S P E D I Z I O N E  I N  A B B O N A M E N T O  P O S T A L E  7 0 %  C N / B OEditoriale del PresidenteL’ECCELLENZA È UN’ABITUDINE74° CONGRESSOLA CRONACA DI UN VIAGGIO INTORNO AL MONDODAI SANTUARI ALLE NUOVE FRONTIEREDELLA VITICOLTURA E DELL’ENOLOGIAPRIMA PARTESPERIMENTAZIONE & RICERCA85DOCUMENTO TECNICON°12 - DICEMBRE 2019NUOVO DISPOSITIVO PER LA STABILIZZAZIONE IN FLUSSO CONTINUO DEI VINI BIANCHIINTRODUZIONE Le proteine del vino possono derivare dalle uve o essere prodotte durante il pro-cesso di vinificazione. Le prime vengono biosintetizzate nell’uva e si accumulano durante il processo di maturazione, le se-conde vengono prodotte dal metabolismo dei lieviti durante la fermentazione, e rila-sciate nel vino a seguito della lisi cellulare dei lieviti stessi.  Il tenore proteico nei vini può variare no-tevolmente, da tracce fino a centinaia di mg/L, e può essere causa di fenomeni di instabilità indipendentemente dalla con-centrazione, inducendo alterazione delle proprietà ottiche, torbidità e formazione di precipitati. Studi scientifici sono stati finalizzati alla comprensione dei meccani-smi alla base del fenomeno di instabilità proteica, ma finora le strutture molecolari e i meccanismi di reazione coinvolti sono stati solo parzialmente elucidati.  L’instabilità proteica viene generalmen-te considerata un processo che si svolge in due fasi: nella prima fase, le proteine vengono denaturate in risposta a specifici fattori (es. variazioni repentine di tempe-ratura), successivamente, in questo nuovo arrangiamento strutturale, esse tendono a produrre aggregati e flocculi in sospen-sione, visibili ad occhio nudo come torbi-dità (Dufrechou et al. 2010). Le proteine presenti nel vino possono essere descritte in base alla loro dimensione e alla carica elettrica, ed entrambe le caratteristiche sono determinanti per la loro reattività.  Diversi studi scientifici hanno eviden-ziato un ruolo primario delle cosiddette Pathogenesis-Related Proteins (PRP) nei fenomeni di instabilità proteica. Le PRP sono caratterizzate da basso peso mole-colare (10–35 kDa), vengono biosintetiz-zate dalla pianta in risposta all’attacco di patogeni e la loro struttura non viene al-terata durante il processo di vinificazione.  Le principali PRP presenti nei vini sono chitinasi, proteine tipo taumatina (TLPs), 1,3-glucanasi e Lipid Transfer Proteins (LTP), (Waters et al. 1996; Pocock et al. 2000; Marangon et al. 2014; Van Sluyter et al. 2015), insieme ad altri piccoli poli-peptidi di varia natura e peso molecolare (Sauvage et al. 2010; Meier et al. 2016; Perutka et al. 2018).   I vini bianchi sono particolarmente incli-ni all’instabilità proteica principalmente a DiGiuseppina Paola ParpinelloArianna RicciMarina SerantoniAndrea BalducciLuigi RagniAndrea VersariAlma Mater Studiorum Università di Bologna - Dipartimento di Scienze e Tecnologie AgroAlimentari - Cesena (FC)giusi.parpinello@unibo.itDa sinistra: Ragni, Balducci, Ricci, Parpinello, Versari, Serantoni.In questo lavoro vengono presentati i risultati preliminari del progetto “Steady Wine”. Vini bianchi proteicamente instabili sono stati stabilizzati con impiego di materiali ceramici in un sistema a flusso. Il dispositivo filtrante ha dimostrato selettività nella rimozione delle proteine e una efficace prevenzione della instabilità proteica, senza influire sui parametri chimici del vino.©Università di Bolognamicrogranina0,5 mm TRATTAMENTOvulcanoM U R E D D U  S U G H E R I1,5 mmT.C.A. & OFF-FLAVOURS FREEPirazine - GeosminaGuaiacoloTrattamentovulcanosotto la soglia di percezione75%sugherominDensitàControllata< 0,5 (± 0,2) ng/L** valore medio del lottoT.C.A.GRAFICA | TAURUSLAB.NETMUREDDUha il tappo2,02,o µ 02 / GiornoO.T.R.OMOGENEOOxigen Transfer Rate senzamicrosfereV i a  S a n t a  M a r i a  7/ 9 20014 Nerviano (MI) - Italiawww.mureddusugheri.comTel. + 39 (0331) 585447+39 331 6818876WhatsApp Customer Care1C O M P R A  I T A L I A N O      A I U T I  I L  T U O  P A E S ESTANDARD LUNGOSPECIALE INNOVAZIONEVERSINIPREMIO ASSOENOLOGI86SPERIMENTAZIONE & RICERCADOCUMENTO TECNICON°12 - DICEMBRE 2019causa del basso contenuto in procianidine, tannini dell’uva coinvolti nella complessa-zione e precipitazione delle proteine insta-bili durante la vinificazione, e tenori varia-bili di PRP possono causare alterazioni ed intorbidimenti durante le lavorazioni e lo stoccaggio, in conseguenza di fluttuazioni di temperature anche di lieve entità.   Sulla base di ciò, si può affermare che la rimozione delle PRP è una questione cruciale per gli enologi al fine di garantire la stabilizzazione a lungo termine dei vini. L’approccio tecnologico più comune consi-ste nell’impiego di coadiuvanti che reagi-scono selettivamente con le PRP, copre-cipitandole dal mosto/vino. Tra questi la bentonite, che agisce come scambiatore cationico interagendo elettrostaticamente con le proteine, è il prodotto maggiormen-te impiegato. Negli ultimi anni sono stati condotti molti studi con l’obiettivo di trovare nuovi agen-ti di affinamento e sperimentare approcci innovativi e più sostenibili per la stabiliz-zazione dei vini su scala industriale. In questo scenario, la nanotecnologia può rappresentare un valido strumento per la progettazione di materiali innovati-vi, le cui caratteristiche strutturali posso-no essere modulate al fine di ottimizzarne le prestazioni. I nanomateriali presentano il vantaggio di poter modulare le proprietà chimico-fisiche del materiale di partenza agendo su dimensioni, forma e geometria delle nanostrutture, e offrono il vantaggio di elevate superfici specifiche per l’assor-bimento (Khan et al., 2017).  Il lavoro qui presentato, denominato progetto “Steady Wine”, descrive la idea-zione di una tecnologia sviluppata presso l’Università di Bologna (brevetto deposi-tato n. 102018000004721), finalizzata all’ impiego di nuovi nanomateriali ceramici per la rimozione delle PRP da vini e mosti attraverso un sistema a flusso continuo; questo approccio risulta adatto per un potenziale trasferimento su scala indu-striale. Lo studio è stato effettuato su vini bianchi caratterizzati da instabilità protei-ca sui quali sono stati valutati i parametri chimico-fisici e la stabilità proteica a lun-go termine a seguito del trattamento con il nanomateriale progettato.  È stato inoltre impiegato un prototipo di dispositivo a flusso, con l’obiettivo di ela-borare un modello previsionale utile a ot-timizzare le caratteristiche del materiale e i parametri di processo indispensabili per il trasferimento tecnologico.MATERIALI E METODI In questo studio sono state impiegate due tipologie di materiali ceramici (MC) food grade, con proprietà fisiche ed elet-trostatiche tali da ipotizzare una capacità di adsorbimento nei confronti delle PRP. I due materiali sono stati testati come nano−polvere (denominati MC1 e MC2, dimensione >100 nm) e micro-polvere (denominati MC1A e MC2A, dimensio-ne >800 nm) per valutare l’impatto della granulometria sull’efficienza di adsorbi-mento delle proteine.  Tutte e quattro le polveri, utilizzate in un range di concentrazione 0,1−4,0 g/L, sono state aggiunte a due vini bianchi entrambi con instabilità proteica (Chardonnay e Mo-scatello casauriense), e lasciate in contat-to fino a cinque giorni. Durante l’esperimento, sui vini trattati sono stati analizzati giornalmente i se-guenti parametri: pH, densità ottica (420 nm), contenuto di proteine totali (PT), polifenoli totali (PFT), e i valori ottenuti sono stati confrontati con il vino di con-trollo (senza aggiunta di MCI o MC2). Per simulare eventuali effetti negativi dovuti alla prolungata esposizione ai materiali ceramici, i vini sono stati altresì sottopo-sti a invecchiamento accelerato (5 giorni a 35±1°C) e analizzati per i sopracitati parametri. La stabilità proteica dei vini è stata valutata utilizzando un test a caldo (he-at-test) basato sulla misura dell’intor-bidimento del vino dopo riscaldamento. In riferimento allo studio della stabilità proteica, prima e dopo i trattamenti si è proceduto ad analisi elettroforetica su gel di poliacrilammide (SDS−PAGE). Tut-ti gli esperimenti sono stati effettuati in duplicato; i risultati sono stati sottoposti ad analisi statistiche mediante l’analisi della varianza (ANOVA) e il post-hoc di Tukey (α: 5%).  A seguito dello screening preliminare, il materiale che ha fornito le migliori presta-zioni in termini di selettività della rimozio-ne delle proteine PR e conservazione della qualità del vino è stato utilizzato per otte-nere una superficie nanostrutturata, nella quale venivano massimizzati i siti di lega-me attivi. Il materiale funzionale è stato ottenuto sottoponendo la nano−polvere a cicli di sinterizzazione ad alta temperatura (Tmax 550°C) per ottenere uno strato meso-poroso, cioè un film con porosità nell’ordi-ne di poche decine di nm.   Ad ultimo, sono state effettuate anali-si al microscopio elettronico a scansio-ne e microanalisi mediante sonda EDS (SEM−EDS) per visualizzare e descrivere dimensionalmente le nanostrutture, e per verificare l’assenza di contaminanti metallici, escludendo così eventuali tra-smissioni al vino.  DISCUSSIONEDEI RISULTATI Le analisi eseguite sui vini dopo il trat-tamento con i due materiali MC di diversa granulometria hanno mostrato un profi-lo sostanzialmente stabile dei parametri analizzati. Ad esempio, in Tab.1 è riportato il valore di pH dal quale si evince che non vi sono variazioni significative rispetto al vino non trattato (CN). Risultano inalterati anche acidità totale e titolo alcolometrico volumico (dati non riportati). Allo stesso modo, la concentrazione dei polifenoli totali (PFT) non ha subito varia-zioni importanti per tutti i materiali MC testati (Fig.1). Le variazioni significative riscontrate tra MC1 e MC1A, con riduzio-ni di composti fenolici nell’ordine di 5−20 mg/L, dal punto di vista pratico sono da considerare di piccola entità e limitate ri-Tab. 1 -  L’impatto dell’aggiunta dei materiali ceramici MC a diversa granulometria e a diverse concentrazioni (0−4,0 g/L) sui valori di pH nel vino Chardonnay dopo cinque giorni di trattamento.pH CN 0,1 0,5 1,0 2,0 4,0MC1 2,93 2,91 2,94 2,93 2,93 2,92MC1 A 2,89 2,89 2,9 2,92 2,92 2,93MC2 2,89 2,91 - 2,93 - 2,94MC2 A 2,93 2,95 - 2,96 - 2,9387SPERIMENTAZIONE & RICERCADOCUMENTO TECNICON°12 - DICEMBRE 2019Tab. 2 -  Riduzione percentuale del contenuto proteico totale nel vino Moscatello casauriense dopo il trattamento con MC1 (pol-vere nanometrica) a diverse concentrazioni (0,1 - 4,0 g/L), PT: Proteine Totali - CN: Controllo.PT (mg/L BSA) CN 0,1 0,5 1,0 2,0 4,0MC1-5 66d 63cd 63cd 56bc 49b 38aΔ (%) - 4,5 4,5 15,3 25,2 42,3spetto alle perdite attese in seguito ai trat-tamenti classici con bentonite, pertanto si ritengono trascurabili rispetto alla qualità del vino trattato. La misura della densità ottica a 420 nm (indice di imbrunimento) è un parametro utilizzato per valutare l’insorgenza di fe-nomeni ossidativi nel vino, che dal punto di vista chimico sono catalizzati da metalli di transizione (es. ferro e rame) che pos-sono essere presenti anche a seguito di Fig. 1 - Contenuto totale di polifenoli (PFT) nel vino Chardonnay dopo cinque giorni di trattamento con i diversi materiali ceramici (MC) utilizzati a diverse concentrazioni. Fig. 2 - SDS-PAGE su vino prima (1) e dopo (MC1) il trattamento; ST: marcatore di peso molecolare.contaminazioni occasionali che si possono verificare lungo le fasi produttive.  In questo studio l’indice di imbrunimento è stato monitorato durante il trattamento con i materiali ceramici in condizioni stan-dard (5 giorni di contatto, temperatura ambiente) e in condizioni di invecchia-mento accelerato (5 giorni di contatto a 35±1°C), per escludere una eventuale at-tività catalitica indotta dal materiale. I ri-sultati hanno confermato che l’utilizzo dei materiali ceramici non determina alcuna variazione della densità ottica a 420 nm (dati non riportati).  Per quanto concerne gli effetti dei ma-teriali ceramici sulla stabilità proteica del vino, il materiale MC1 è risultato partico-larmente incline a rimuovere le proteine PR, stabilizzando i vini. La Tab.2 riporta il contenuto proteico totale (PT) dei vini dopo cinque giorni di contatto (MC1−5) con il materiale attivo; i risultati evi-denziano una riduzione significativa con l’impiego di concentrazioni crescenti del materiale MC1.  L’analisi SDS−PAGE ha confermato la ri-mozione delle proteine con peso moleco-lare <35 kDa (Fig. 2) e ha dimostrato effi-cacia ed elevata selettività di MC1 quando utilizzato nel trattamento del vino instabi-le alle concentrazioni maggiori (4 g/L). I risultati hanno mostrato che, massimiz-zando la superficie disponibile per l’assor-bimento, MC1 può produrre una efficace stabilizzazione proteica. La nanotecnologia, consentendo di mo-dulare dimensione e distribuzione delle strutture nanometriche, offre la possibi-lità di progettare materiali con superfici attive che presentino le caratteristiche volute. In questa ottica, la sinterizzazione permette di ottenere questa tipologia di materiali su larga scala.  Il processo prevede l’applicazione di emulsioni di nanoparticelle (dimensio-ni nell’ordine di 10-100 nm) su supporti inerti di grandezza e dimensione variabili; il supporto cosi funzionalizzato viene sot-toposto ad un adeguato trattamento ter-mico, che consente alle nanoparticelle di organizzarsi in una struttura mesoporosa (Fig. 3) simile ad una “spugna” con pro-prietà chimico-fisiche simili al materiale nanometrico di partenza e in grado di sod-disfare i requisiti di sicurezza attesi per un materiale ad uso alimentare. I materiali funzionali ottenuti con questo procedimento sono stati utilizzati per defi-nire il rapporto superficie materiale attivo/volume di vino da trattare; a tal fine tutti i campioni di vino trattati sono stati sotto-posti a heat-test per valutare la variazio-ne di torbidità (ΔNTU); ciò ha permesso di quantificare l’estensione della superficie attiva necessaria per la stabilizzazione del vino (Fig.4a, b).  Il punto stazionario nella curva (a) cor-risponde alla superficie necessaria per la completa stabilizzazione proteica del vino, mentre nella curva (b) corrisponde 88SPERIMENTAZIONE & RICERCADOCUMENTO TECNICON°12 - DICEMBRE 2019alla massima percentuale di proteine as-sorbite. Nel materiale è stata valutata la capacità di rigenerazione tramite cicli di lavaggio blandi, con soluzioni debolmente alcaline. I primi risultati hanno mostrato una buona capacità di ripristino delle pro-prietà adsorbenti.  I materiali funzionali ottenuti sono at-tualmente utilizzati per trattamenti di piccoli volumi in regime di flusso, con l’obiettivo di definire numero di cicli, du-rata e portata del trattamento utili ad un processo di scaling-up per l’applicazione a livello produttivo.CONCLUSIONI EPROSPETTIVE FUTURE In questo lavoro sono stati perseguiti due obiettivi principali finalizzati alla sta-bilizzazione proteica dei vini: a) l’indivi-duazione di materiali adsorbenti ceramici innovativi, con capacità di adsorbimento selettivo e caratteristiche food grade; b) rimozione delle proteine responsabili del-la instabilità dei vini bianchi senza altera-zione dei parametri chimici. La prosecuzione dello studio prevede la realizzazione di un sistema ‘pilota’ che consenta il trattamento in flusso continuo.Il presente lavoro è tutelato tramite do-manda di brevetto (numero di brevetto 102018000004721), i cui diritti di proprietà intellettuale appartengono all’ Alma Ma-ter Studiorum - Università di Bologna. RingraziamentI. Gli autori ringraziano la dottoressa Elena Babini (UniBo) per le analisi SDS-PAGE.                                          BIBLIOGRAFIA Dufrechou, M., Sauvage, F. X., Bach, B., & Vernhet, A. (2010). Protein aggregation in white wines: influence of the temperature on aggre-gation kinetics and mechanisms. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58, 10209-10218. Khan, I., Saeed, K., & Khan, I. (2017). Nano-particles: Properties, applications and toxi-cities. Arabian Journal of Chemistry. doi.or-g/10.1016/j.arabjc.2017.05.011 Marangon, M., Van Sluyter, S. C., Waters, E. J., & Menz, R. I. (2014). Structure of haze forming proteins in white wines: Vitis vinifera thaumatin-like proteins. PloS One, 9, e113757. Meier, M., Jaeckels, N., Tenzer, S., Stoll, M., Decker, H., Fronk, P., & Will, F. (2016). Impact of drought stress on concentration and com-position of wine proteins in Riesling. European Food Research and Technology, 242, 1883-1891 Pocock, K. F., Hayasaka, Y., McCarthy, M. G., & Waters, E. J. (2000). Thaumatin‒like Pro-teins and Chitinases, the haze-forming pro-teins of wine, accumulate during ripening of grape (Vitis vinifera) berries and drought stress does not affect the final levels per berry at ma-turity. Journal of Agricultural and Food Chemi-stry, 48, 1637-1643. Sauvage, F. X., Bach, B., Moutounet, M., & Vernhet, A. (2010). Proteins in white wines: Thermo-sensitivity and differential adsorbtion by bentonite. Food Chemistry, 118, 26-34. Van Sluyter, S.C., McRae, J.M., Falconer, R.J., Smith, P.A., Bacic, A., Waters, E.J., Ma-rangon, M. (2015) Wine Protein Haze: Mechani-sms of Formation and Advances in Prevention. Journal of Agricultural and Food Chemistry 63,4020-4030.  Waters, E. J., Shirley, N. J., & Williams, P. J. (1996). Nuisance proteins of wine are gra-pe pathogenesis-related proteins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44, 3-5.Fig. 3 - Le immagini SEM del materiale mesoporosa prodot-to tramite sinterizzazione: sezione (a.) e superficie (b.) dello strato attivo. In basso, i film mesoporosi depositati su vetro inerte utilizzati per gli esperimenti (c.).Fig.4 -Relazione tra superficie di materiale attivo (MC1) e rimozione delle proteine. (a) Variazione della ΔNTU all’aumento della superficie attiva di MC1. (b) Adsorbimento di proteine (%) all’aumento della superficie attiva di MC1.ab

Nuovo dispositivo per la stabilizzazione in flusso continuo dei vini bianchi

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