Akemi Nakata

Kozo Nishio

Rika Tanaka

Toshiko Morishita

中田 朱美

森下 敏子

田中 里香

西尾 康三

English

森下, 敏子

8990

モリシタ, トシコ

MORISHITA, Toshiko

田中, 里香

9017

タナカ, リカ

TANAKA, Rika

中田, 朱美

9018

西尾, 康三

9019

ニシオ, コウゾウ

NISHIO, Kozo

Nakata, Akemi

9022

Mukogawa Women’s University Repository / 武庫川女子大学リポジトリ

Bul. Mukogal仰 Women'sUniv. Nat. Sd.， 40， 1-6(1992) 武庫川女子大紀要(自然科学)パンベイユ (Citrusgrandis Osbeck forma Banpeiyu) におけるリモノイドの移行森下敏子，田中里番，中田朱美，商罵康Z(武庫川女子大学家政学部会物学科)Translocation of limonoid in the Banpeiyu fruits Toshiko Morishita， Rika Tanaka， Akemi Nakata and Kozo Nishio D句partmentFood Science， Faculty 01 Home Economics， Mukogal叩 Women包 University，Nishinomiya 663， Japan The existence of limonoid in the tissue of Banpeiyu (Citrus grandis Osbeck forma Ban-peiyuHoliage were investigated by HPLC and microscopy. Observation revealed limonoid in the phloem of the stem. Around the cortex cels were dark materials insoluble in water and soluble in dichloromethane， acetonitrile， ethyl acetate and chloroform. The amount of limonoid in the Banpeiyu leaves were indicated 3.7 ppm of limonin， 20.4 ppm of nomilin， 4. 8 ppm of obacunone. The crystalline substances exracted from the Banpeiyu leaves were detected the same retention time as nomilin by HPLC method. カンキツ巣肉に含まれる苦味成分の中でもザモノイド類は果実の成長に伴い減少し果皮および稜子に蓄積されると報告1)-3)されているが.果実に移行するまでの哀楽中での苦味成分の存在状態や移行経路についての詳細は明らかにされていない.Hasegawaは放射性向位元素トレーサ…実験により， リモノエイト酸A環ラクトンがカンキツの若葉でさかんに合成されると報告している 4).苦味物質の代謝過程を知ることにより，苦味の効果的な除去および収穫以前の苦味抑制も可能ではなし、かと考え，カンキツの葉柄中におけるザモノイドの存在および移行経路について検討した.実験方法1. 材料および試料調製材料として熊本県農業技術センター，果樹研究所で9月， 10月 12月月に採取したパンベイユ(晩自柏， Citrus grandis OSBECK forma Banpeiyu) の若葉および葉柄を用いた.業の試料調製は橋永氏らの方法5)にしたがって行った.すなわち余葉75gをマノレチカッターで熔砕し 4倍設の 0.2Mトリス緩衝液(pH8.0)を加えて24時間室混に保ち不溶性リモノイドを可溶化した.次にこれを遠心分離し (9，000 r.p.m， 20分， O"C)上澄液をろ過した後， 30/0塩酸で溶液のpHを2に調製し， 120m!の酢酸エチノレで、2mリモノイドを抽出した.減圧乾留したのち75%メタノー ノレ7m!に溶解し0.45mμ のメンプランプィノレターでろ過した.さらに酸性りそノイドは次の方法により抽出した.J二記の抽出液のうち 1m!を分液ロートにとり，さらに33m!のジタロノレメタンと 35m!の5%炭酸水素カリウム溶液を加えて 3分間娠とうし，中性リモノイドな除去した.水溶液のpHを3%塚酸で2に調薬しザよそノイドの D潔を閉環させたのちジクロノレメタンで2@]抽出した.溶媒を揮散させたのち得られた談役ワモノイドをKuhn法的に準じてメチノレイヒした.すなわち乾顕した試料を 1m!のジメチノレホノレムプノレデヒドに務解し， 0.5m!のヨウ化メチノレおよび1.5gの乾燥Ag20を加え封管した. 37"Cで6時間反応させた後夜室温に放置し，遠心分離を行いJ二澄を採取した.減圧乾臨し 1m!のプセトニトリノレ???。?Fig. 1. Seasonal changes of limonoid in the leaves and stems of Banpeiyu 0--0 leaves .一…@O ー‘.-A 。、段 ¥r一一o一一一。¥‘酪 .... ーー ーー 怒ー幽一一一一一……一…一 m 一}一…-一一一-e一一一一一-stems 12 A 12 10 11 Month 11 Month A 、A 10 9 9 (森下，邸中，中田，蔚尾)E a c. 60 刀o c o E ち 40c o . 悶』. c Q) () g 20 u 80 E 60 c. c. O 守田× ミ5"40 0 c O E '+-o c: 20 0 . '" 』. c Q) () c o u O に溶解して HPLC用試料とした りそノエイト A潔ラクトンの分析は Chandlerの方法 7)によりリモニンをラクトン化した後 Maierらの方法8)により TLCで定性し， HPLCで分析した薬柄の試料調製は次の方法で行った.表皮(多}轡表皮)，皮層細胞，飾部の!般にカミソワで削りとり，おのおのを採取し， 19ずつを乳鉢で磨砕し築と同様の方法でザモノイドを抽出し， HPLC用試料とした.2. HPLCによるリモノイドの澱定的分析装援は日本分光製TWINCL怠， UVIDEC 1∞網目を用いた.カラムはCosmosil5C18 packed column (半弁化学製， 4.6 x 150阻 Jasco)を用い，カラム温度35'Cで215nmの吸光度を測定することによって各リモノイド合盤を求めた.移動相は水とメタノ…ノレを 25:75(V IV%)に混合したものを用い分間に0.2mlの流速で流してリモノイドを溶離した.定f設は向一試料で3回の測定値の誤慈が:t0.1%になることを磯認して定盤儀とした3. 顕微鏡綴察装霞は顕微鏡， NIKON OPTIPHOT XF-31，写哀擬影装置 NIKONM・35FAを用いた.種子を安全カミソりの刃で横 112に切断し接着剤を用いユワトコに接着した.これをプッカーミク戸トームに国定し24μmの厚さの切片を作成した:切片はろ紙上にとり，スライドガラス上で水を 2，3滴スポイドで滴下してプレパラートを作成し，鏡検を行った.葉柄の切片の作成は以下の方法で行った.葉柄を安全カミソリで1 cmに切断し接義剤jでユワトコに接着し，フッカーミクロトームで24μmの切片を作成した.切片をろ紙上に採取し， ラクモイド(レゾノレシンフツレー 0.05gを炭殻ナトリウム 0.2gを含む 30%エタノール 20mlに溶解)で 10分間染色後，反応、mで3白水洗し，プレパラートを作成した.発色予測には p-ジメチノレアミノベンズアノレデヒド Igを水 37mlに撮酸4.8mlを加えた溶液に溶解したものを用いた.extracted 0--0 limonin 鶴一一一圏 nomilin⑧一一⑫ obacunonej. ••• ••• j. limonoate A -ring lactone Fig. 2. Seasonal changes of limonoid from the Banpeiyu stems の部位へ移行したことが示唆された.葉柄やの各ジモノイドの季節約変動をFig.2に示した. 担モニンおよびノミリンは9月から翌年の 1月にかけて減少し， りそニ、ノはほぼ消失した. 担モノエイ2 9月， 10月， 12月および l月に採取されたパンベイユの薬および葉柄の表皮，皮j欝，飾部よりそノイドを抽出し， HPLCでリモノイド盤を測定した結果をFig .1 に示した.薬では総、ザモノイド議は 10月から12月まで約27%増加し月にかけては約 13%減少したのに対し，業柄では9月から 10刃にかけてやや増加したのが，その後1月にかけて約 16%減少し，葉では 12月以降，業柄では 10月以降リモノイドが他実験結果および考察パンベイユ (Citrugrandis Osbeck forma Banpeiyu)におけるリモイドの移行モノイドの含有盆と季節的な変動が少ないことを認めた.これより， 10月では主主の表皮，皮麿に合成されたりそノイドが貯蔵され， 12月では飾部へソース内短距離移動14)が起こったことが挽定された.ε60 c. a o ????????? ? ????????』??? ? ?ペ1二;ミヘ/10 11 Month Fig. 3. Seasonal changes of limonoid in the Banpeiyu stems 0--0 epidermis and cortex 口一一己 Phloem 1;，.--…1;，. xylem and pith 12 9 O トA潔ラクトンは 9月から 10J3にかけて約 320/0減少したが，以後 12月にかけて約82%の顕著な増加を示した.オバクノンには変化はみられなかった.オパグノン霊童は 10月までやや増加したが，その後，他のリモノイドと同様に減少傾向を示した.長谷川らにより，菜では酢酸，メバロン酸およびファノレネソーノレリン殺などよりノミリンが合成されると報告 10)-13)されているが，パンベイユでは9月にノミリン量が多く 12月から l月にかけて減少した.リモニンもノミリンと同様の傾向を示したが， リモノエイトモノラグトンと推定されるピークは 10月からl月にかけて顕著に増加した.これよりパンベイユでは9月以前にノミリンが合成され，果実の成熟期には無味のリモノイドに代謝されることが推定された.業柄の部位別のリモノイド盤を検討した結果をFig .3に示した.表皮，皮膚にリモノイドは多く含まれており 9月から 10J3にかけて約2倍の顕著な増加を示し 10月でピークを示した.さらに 12月にかけて約60%減少した.飾部では表皮，皮震とは対照的な増減を示し 9月から 10月にかけて約45%減少し，その後 12月にかけて約2.5傍の顕著な増加を示した.木部および髄では9月から 10月にかけてやや増加したが， 12月には再び減少し，皮}習に比べ， リxylem and pith phleom epidemis and cortex ?????Time(min.l HPLC chromatograms of limonoid extracted from the Banpeiyu stems 3-Time{min.) Time{min.) Fig.4. (森下，図中，中関，西尾)さらに， Fig.4に玉沢したように， リモノエイト A環ラクトンは表皮，皮層，飾部，木部，髄のすべての部位で検出されることより， ザモノイドの薬続中では担モノエイト A潔ラクトンが存在することが推定された.薬におけるリモノエイト A環ラクトンの季節約な変動を Fig.5に示した. ザモノエイト A環ラクトンは薬では9月から 12月にかけて約2.7倍の顕著な増加を示したのに対し， Fig.2に示したように，葉柄では9月から 10月に減少し 10月以降は顕箸な増加を示した.これより 9月から 12月にかけて葉ではりモネノエイト A潔ラクトンが存在し，葉柄では果実の稔突期である 12月にかけて飾管を通って，果実に移行することが推定され， Fig.3に示したように，業柄の餓管がリモノイドの移行の通路であることが示唆された.このことは， りチヤードソンにより，飾部は主義で、主主合成された有機同化産物が上方へも下方へも輸送される組織であり，移動の通路は飾管であると確認されていること 15)とも一致した.ε a a 80 ~ 60 て30 c o ε ‘←ーo 40 c o やd伺』+' c Ql () 5 20 ιJ O A. 。'AA' A' ム/一九一¥圏.'滋号 、 _Ag〉ベ署長一@ここ二三二二39 10 11 12 Month Fig. 5. Seasonal changes of limonoid extracted from the Banpeiyu leaves 0--0 limonin 関……圏 nomilin⑫ー…⑫ obacunone.--.... A. limonoate A -ring lactone HPLCの結果より，業柄の皮}欝および飾部に木部や髄にくらベリモノイドが多く検出されたため， 12 月のパンベイュ葉柄を用い，検鏡によりリモノイドの確認を行った.パンベイユの哀の縦断面の検鏡を行った結果:z-Fig .6に示した.切片をラクモイドで 10分間染色し，簸管の佼援を縫認したのち，p-N-ジメチノレプミノベンズアノレデヒド浴液を滴下したところ，筋管の脊色は消失し，餓部に不定形の結晶が認められ褐色に長色した.さらに同様の方法で 1070塩化第二鉄溶液で染色した結果，綴管の青色は消失し，その結晶部分が紫色に長色した.これより， OH基を有する担モノイドではないかと推定された.茎縦断簡に酢酸エチノレおよびジクロノレメタンを滴下したところ結晶が消失したため，この結晶宅どりそノイドと認定した.同様にバンベイュ茎の横断言立の検鏡を行った結果，上記結晶の存在および酢酸エチノレ，ジクロノレメタンによる消失 (Fig.7)を認めた.これらは飾部柔細胞および放射組織に局夜した.さらにパンベイユの葉の築肉縦断面の検鏡を行った結果をFig.8に示した.パンベイユの棄は背渡性薬であり，外見上からも区別出来るが，検鏡結楽より表側には築緑体が築積し，築側tこ陪色不定形の物質が多数検出された.酢霊童エチノレおよびジクロルメタンを滴下したところ，この物質は溶解し消失したため，暗色不定形物質はりそノイドと推定された.G.A.ストラッフォードにより，有機代謝産物の移動は富市部で行われることはほぼ疑いないとされ，飾部が有機物の輸送にあずかる主要な組織であるとされている叫.さらに，禁中の塚類は色々な代謝反応、に繰り込まれるが，不婆なものは時には薬から飾部へ送りこまれて，根，若葉，成長点，発途中の花や果突などへ移動するとされており，このような変化と苦味物質の移行に類似性が見出されることは，横物体における苦味物質の存在の意味を知る上からも興味あることと考えられた.4-バソベイユ (CitrugrandisOsbeckformaBanpeiyu)におけるリモイ ドの移行IS.Tq5;- .毒1:dyedwithlacmoid~rtT+2 :dyedwithirondichloride3:treatedwithdicHoromethaneFig.6.MicrographsofthelongitudinalsectionoftheBanpelyuStem (20×15)1:controll:dyedwithlacmoid2 :dyedwithp-N-dimethylaminobenzaldehyde:fiq oT儀 .声QT3:treatedwithdichloromethaneFig.7.Micrographsofthecrosssection oftheBanpelyuStem (20x15)2 :treatedwithdichloromethaneFig.8.MicrographsoftheBanpeiyuleaf15-(20×15)(森下，田中，中田，西尾)本研究の試料のバンベイユをご提供下さいました熊本県幾業研究センター果樹研究所の桝1 英雄氏に深謝申しあげます.なお，本研究は平成5e年度文部省科学研究助成金の一部を用いて行った.文 献1)長谷川信，化学と生物， 21， 823 (1983) 2) Hasegawa， S. et al.， Phytochemistry， 23， 1601 (1984). 3) Hasegawa， S. et al.， Phytochemistry， 27， 115 (1988). 4) Hasegawa， S. et al.， Phytochemistry， 16， 469(1977) . 5)橋永文男，長谷川信，園学雑， 58， 227(1989). 6)山JI民夫，生化学実験講座 4 糖質の化学下(東京化学問人，東京)， p. 508 (1979). 7) B.V.Chandler， J.Sci.Fd.Agric.， 22，635(1971). 8) V.P.Maiyer et al.， Phyto chemitry， 18， 405(1969). 9)森下敏子，陣内弘子， {I中地久子， 日食工誌，32， 590(1985). 10) S. Hasegawa， J. E. Hoagland， Phytochemistry， 16， 469 (1977) 11) Hasegawa， S.， R. D. Benett and C. P. Ver-don， J Agric. Food Chem， 28， 922(1980). 12) Hasegawa， S.， Z. Herman， E.Orme and P Ou， Phytochemistry， 25， 2783 (1986). 13) Hasegawa， S.， ACS Symp.， American Chemi. Society， p. 84(1990). 14)長南信雄:化学と生物， 24， 91 (1986). 15) M.リチャードソン，植物の物質輸送(朝倉書庖，東京)， p. 45 (1980). 16) G. A. Stratford，植物の代謝(湾出書房新社，林孝三訳，東京)， p.133(1973). 6-

Translocation of limonoid in the Banpeiyu fruits

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バンペイユ（Citrus grandis Osbeck forma Banpeiyu）におけるリモノイドの移行

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