Qian, Zhi-Rong

Sano, Toshiaki

Yamada, Shozo

Yoshimoto, Katsuhiko

English

Tokushima University Institutional Repository

成長ホルモン（GH ）産生腺腫における DNA メチル化異常の解析はじめに徳島大学大学院ヘルスパイオサイエンス研究部分子薬理学分野徳島大学大学院ヘルスパイオサイエンス研究部人体病理学分野徳島大学大学院ヘルスバイオサイエンス研究部人体病理学分野虎の門病院内分泌センタ一間脳下垂体外科吉本勝彦銭志栄佐野毒昭山田正三最近、癌抑制遺伝子の不活化の新たな機構として、 DNA のメチル化の関与が注目を集めている 1）。我々は下垂体腺腫における RASSFIA 遺伝子発現低下がプロモーター領域のメチル化によることを明らかにした 2）。本研究においては、接着因子である H-cadherin 遺伝子（CDH13 ）およびE-cadherin 遺伝子（CDHI ）を対象として、 GH 産生腺腫を含めた下垂体腺腫におけるDNA メチル化による不活化機構と腺腫の臨床病理学的特徴との関連性を検討した。研究方法1. CDH13 とCDHI のプロモーター領域のメチル化の解析24 例の GH 産生腺腫および2例の GH・ プロラクチン産生腺腫を含む 69 例の下垂体腺腫における CDH13 とCDHI のプロモーターのメチル化を解析した。 5例の正常下垂体および下垂体腺腫より抽出したゲノム DNA を、 CpGenome DNA modifcation kit (Intergn 社）で処理した。処理済みゲノム DNA を鋳型にして、メチル化を認識するプライマー対および非メチル化を認識するプライマ一対を用いて PCR を行った（メチル化感受性 PCR 法）。ヒトゲノム DNA をCpG メチラーゼでメチル化したものを陽性コントロールとして用いた。またバイサルファイトで処理済みゲノムDNA を鋳型としたPCR 産物をベクターにクローニングし、数個のクローンの塩基配列を決定することにより、両遺伝子プロモーター領域のCpG アイランドのメチル化について検討した（バイサルファイト．塩基配列決定法）。それぞれのプライマーの塩基配列は既報に従った-279-2. 半定量的 RT-PCR 法による CDH13 mRNA の解析正常下垂体および腺腫より抽出した RNA を用いて、 RT-PCR を行い、 CDH13 mRNA 量を半定量した。プライマーの塩基配列は既報に従った3.4 ）。 内部コントロールとして、グリセアルデヒドー3－リン酸 脱水素酵素（GAPDH ）を用いた。 PCR 産物をアガロース電気泳動にて分離後、エチジウム ブロマイドにて染色した。それぞれの mRNA レベルは NIH image にて定量を行い、 CDH13 mRNA とGAPDH mRNA の比（CDH13mRNA /GAPDH mRNA ）として表示した。3. 免疫組織化学における E-cadherin の発現の検討ホルマリン固定パラフイン包埋標本について、モノクロナル抗 E-cadherin 抗体(Transductio Laborties 社）を用いて免疫組織化学をおこなった。陽性コントロールとして正常表皮を用いた。正常表皮で認められるように、シグナルが細胞膜に局在した場合を陽性細胞とした。また、シグナル強度および陽性細胞の割合を半定量的に表した。腺腫における陽性細胞の分布は 5段階に、シグナル強度は 3段階に分類した。両者を組み合わせて 0 から 6 に表示し、 1-3 のスコアを発現減少とした。結果1. CDH13 とCDHl のプロモーター領域のメチル化の解析メチル化感受性 PCR の代表的な結果を図 1に示す。CDH13 とCDHl のプロモーター領域のメチル化状況と 69 名の下垂体腺腫患者の臨床病理学的特徴の関連性を表1に示す。 CDH13 とCDHl のメチル化は、それぞれ下垂体腺腫の 30% および 69% に認められた。正常下垂体においては、いずれもメチル化は認めなかった。このうち GH 産生腺腫においては、 CDH13 では 25% に、 CDHl では 21% にメチル化を認めた。機能性腺腫（CDH13 、31%; CDHl 、31% ）と非機能性腺腫（CDH13 、29% ; CDHl 、46% ）間では、メチル化の頻度に差異を認めなかった。CDH13 のメチル化は、非浸潤性増殖を示す腺腫（19% ）よりも浸潤性増殖を示す腺腫（42% ）で高頻度に認められた（表2）。また、 CDHl のメチル化は、グレード Iを示す腺腫よりもグレード IV を示す腺腫（42% ）で高頻度に認められた。CDH13 あるいはCDHl のいずれかにメチル化を認めるのは 51% で、グレード Iあるいは非浸潤性腺腫よりもグレード IV あるいは浸潤性腺腫で高頻度に認められた。-280 一一部の腺腫において、メチル化感受性PCR の結果とバイサルファイトー塩基配列決定法の結果を比較検討したところ、 2つの方法の結果は一致していることを確認した OA 3似均2倒防PC M Tl i. u !12 TlS M u M u TG NI w ti w 掴圃iiiB 12.Sbp • i倒均’PC M hu ω… τ川U滅tu a a e山帯am令M織やH M叩 均一一－v fu源m 図 I CDH13 (A ）およびCDHl (B ）遺伝子プロモータ一部位のメチル化感受性PCRA 下垂体腺腫 2、7. 12 で CDH13 遺伝子プロモータ一部位のメチル化を認める。B 下垂体腺腫 4. 17. 36. 51 で CDHl 遺伝子プロモータ一部位のメチル化を認める。M はCpG がメチル化されている場合に増幅するプライマーを、 U は非メチル化されている場合に増幅するプライマーを用いた。PC はメチル化の陽性コントロールを、Nl 、N4 は正常下垂体を示す。2. CDH13 mRNA の解析5例の正常下垂体においては、いずれも高い発現レベル（CDH13 mRNA I GAPDH mRNA 0.85 ・1.09 、平均0.97 ）を認めた（表3）。個々の下垂体腺腫に対応する正常下垂体は得られないため、 CDH13 mRNA /GAPDH mRNA が 0.48 以下を、 CDH13 の発現量の減少と判定した。発現消失と発現減少は、それぞれ 6例、 16 例の腺腫に認められた。CDH13 mRNA の減少は非浸潤性増殖を示す腺腫（27% ）よりも浸潤性増殖を示す腺腫（61% ）で高頻度に認められた。-281-』i EI－ －T町il i1 te’ll jji－－Hili－－－－1 3. E-cadherin の発現の検討5例の正常下垂体において E-cadherin はほとんど全てのホルモン産生細胞の細胞膜に発現が認められた。 E-cadherin の発現は、 30% の腺腫で消失を、 32% の腺腫で減少を認めた。軽度の発現減少あるいは正常発現は－38% の腺腫に認められた。また、非浸潤性でミクロの腺腫よりも、浸潤性（グレードIV およびIII ）およびマクロ（グレードII) の腺腫で有意に発現減少が認められた。しかし、グレード IV 、III およびII 間では差異は認められなかった。E-cadherin の発現は fibrous body を有する 8例の GH 腺腫では全てにおいて発現が低下していた。一方、 fibrous body を有さない 16 例の GH 腺腫では、 1例を除いて発現が認められた。またプロラクチノーマにおいては女性よりも男性患者で発現が低下している傾向を認めた。4. CDH13 とCDHl のプロモーター領域のメチル化と発現低下との関連両遺伝子ともにメチル化を受けていない正常下垂体においては、高い発現レベルを有していた（表4）。 CDH13 の低メチル化を示した 70% の腺腫において、発現レベルは正常で、あった O 逆に CDH13 のメチル化を有する 69% の腺腫に発現の低下を認めた。CDHl の低メチル化を示した52% の腺腫において、発現レベルは正常であった O CDHl のメチル化を有する 88% の腺腫に発現の低下を認めた。考察細胞接着因子は、細胞聞の機械的な接着のみならず、細胞の増殖、分化、アポトーシスなどの基本的な細胞活動に関与している。細胞問あるいは細胞・細胞外マトリックス問での変化は、浸潤性や転移に関与することが知られている 5）。これまでに、種々の腫蕩でCDH13 とCDHl のプロモーター領域のメチル化による発現異常が報告され、腫蕩化・浸潤性との関連が検討されている 3.4.7 ）。下垂体腺腫における CDH13 とCDHl のプロモ｝ター領域のメチル化は、それぞれ30%および 36% に認められた。両遺伝子のメチル化は GH 産生腺腫を含めた全てのタイプの腺腫および全ての腫蕩ステージで認められた。これらのメチル化と発現減少の有無については有意な相関が認められた。これまでの報告および本研究結果より、下垂体の腫蕩化においてメチル化の異常が大きく関与していることが明らかとなった。-282-CDH13 のメチル化は浸潤性の高い腺腫で、高頻度に認められ、グレードの程度とも関連が認められた。また、発現低下も腺腫の浸潤性との関連がみとめられた。これらの結果から、 CDH13 のメチル化による発現低下は、他の種類の腫蕩と同様に下垂体の腫蕩化に関与していると考えられる 4. S.10 ）。ただし、 H－カドヘリンは細胞内ドメインを欠いているため、細胞間接着とは別の機構で腫蕩化に関与している可能性がある。E－カドヘリンに関して、我々はプロラクチノーマにおける発現低下が腫蕩サイズや浸潤性と関連があること 11 ）、 fibrous body を有する GH 腺腫では発現が低下していることを報告している 12 ）。本研究においては、 CDHl のメチル化はグレード IV の腺腫で高頻度に認められること、発現低下は全てのタイプの腺腫で認められ、腫蕩のサイズや浸潤性と関連があることを明らかにした。 CDH13 とCDHl のプロモーター領域のメチル化が両方の遺伝子に認められたのは 1 個存在し、いずれもグレード II 、IL IV のステージであった。以上の結果より、 CDH13 とCDHl 遺伝子のメチル化による発現低下が、 GH 産生腺腫を含めた下垂体腺腫の伸展に関与している可能性が示唆されるとともに、腺腫の伸展性の予知因子となりうる可能性を有することが明らかとなった。文献1. Herman JG, Baylin SB: Gen silencing in caner in asociation with promte hypermthylation. N Engl J Med 349: 204 ・2054, 203 2. Qian ZR, Sano T. Yoshimt K. Yamada S, Ishizuka A. Mizusaw N, Horiguchi H, Hirokaw M, Asa SL. Inactivation of RASFlA tumor supreso gen by aber-rant promte hypermtlaion in human pituitary adenoms. Lab Invest 85: 464-4 73, 205 3. Sato M. Mori Y. Sakurd A Fujimra S, Hori A: H-cadherin (CDH13) gen is inactivated in human lung cancer. Hum Gent 103:96 ・101, 198 4. Toyka KO, Toyka S. Virman AK. Sathynr UG, Euhs DM, Gilcrease M, Mina JD, Gazdr AF: Los of exprsion and abernt methylaion of the CDH13 (H-cadherin) gen in breast and lung carinomas. Cancer Res 61:456-4560, 201 5. Herman JG, Gra 妊 JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB : Methylation-specifc -283-i！ ！li JJhHrlμ II 町PCR: a novel PCR asy for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA 93: 9821 ・9826, 196 6. Cavlaro U, Christofri G : Cel adhesion and signaling by cadherins and lg-CAMs in cancer. Nat Rev Cancer 4:18-132 204 7. Strahde G: Epigentic versu genetic alterations in the inactivation of E-cadherin. Semin Cancer Biol 12:373-12379, 20 8. Le SW: H-cadherin, a novel cadherin with growth inhibitory functions and dimin-ished expresion in human breast cancer. Nat Med 2:76-782, 196 9. Maruyama R. Toyka S, Toyka KO, Hard K. Virman AK, Zochbauer-Muler S, Farinas AJ, Vakr-Lopez F, Mina JD, Saglowsky A, Czerniak B, Gazdr AF : Aberant promte methylation profile of blader caner and its relationship to clinicopathological features. Cancer Res 61:8659 ・863, 201 10. Takeuchi T, Liang SB, Matsuyohi N, Zhou S, Miyach Y, Sonbe H, Ohtsuki Y : Los of T-cadherin (CDH13, H-cadherin) expresion in cutaneous squamos cell carinoma. Lab Invest 82:1023 ・1029,0211. Qian ZR, Li C, Yamski H, Mizusaw N, Yoshimt K. Yamada S, Tashiro T, Horiguchi H, W aktsuki S, Hirokaw M, Sano T : Role of E-cadherin, alpha-, beta-, and gam-catenis, and pl20 (cell adhesion molecules) in prolactinoma behav-ior. Mod Pathol 15:1357-1365 20 12. Xu B, Sano T, Yoshimt K. Yamada S: Downregulati of E-cadherin and its undercoat proteins in pituitary growth hormne cell adenoms with prominet fibrous bodies. Endocr Pathol 13: 341-351 20 -284-表 L 下垂体腺腫における CDH13 およびCDHI プロモーターのメチル化Variable No. CDH13 methylaion CDH I meth ylatio n ＋ p ＋ p Patients 69 21 (30 % ) 48 (70%) 25 (36 %) 4 （臼%）Age (yr) 43 .6 ± 3.2 48.4 ± 2.3 0.25 47.7 ± 3.6 46.5 ± 2.2 0.75 Gendr 0.28 0.60 Male 3 8 (2 4% ) 25 (76%) 13 (40%) 20 約0%)Femal 36 13 (36 % ) 23 (64%) 12 (3 %) 24 (67 % ) Funct ion al adenomas GH 24 6 (25% ) 18 (7 5%) 5 (21%) 19 (79%) GH /PRL 2 I (50%) I (50% ) 。 2 (10%)PRL 12 4 (3%) 8 (67%) 6 (50 %) 6 (50 %) ACTH 4 I (25 % ) 3 (7 5%) I (25% ) 3 (7 5% ) TSH 3 2 (67 % ) I (3%) 2 (67%) I (3%)Total 45 14 (31% ) 31 (69 % ) 14 (31 % ) 31 (69%) Non-fuct ion al adenomas Tota l 24 7(29%) 17 (71 % ) 1 (46%) 13 (54%) Norma l pituitary 5 。 5 (10 % ) 。 5 (10 % ) 表 2. CDH13 およびCDHI プロモーターのメチル化とグレード・浸潤性との関連Variable No. CDH13 methyla ion CDH I methylation69 ＋ p ＋ p Grade 9 I (1%) 8 (89%) 1(1 % ) 8(89%) II 27 6 (2 2% ) 21 (78%) 0.4 • IO (37% ) 17 (63%) 0.1 , III 25 IO (40%) 15 (60%) 0.1 h 9 (36 % ) 16 (64%) 0.1 b IV 8 4 (50 % ) 4 (50 % ) 0.08 C 5 (63%) 3 (37 % ) く 0.05 C Invasion く 0. 05 0.31 Invasiv e 3 14 (42 % ) 19 (58 % ) 14 (42 % ) 19 (58%) Nonivase 36 7 (19 % ) 29 (81 % ) 1 (31%) 25 (69 % ) a: II vs I・ b: III vs I・ c: IV VS I. 一沼s-表 3. 下垂体腺腫における CDH13 発現CDH13 mRNA expresion No. ー±• + p Invasive 23 3 (13%) 1 (48%) 9 (39%) < 0.05Nonivase 29 3 (10%) 5 (17%) 21 (73%) a 土：線腫における CDH13 mRNA レベルが正常下垂体に比べて優位に低下している。表 4. CDH13 およびCDHI プロモーターのメチル化と遺伝子発現との関連CDH13 mRNA No. CDH13 methylation E-cadherin No. CDHl methylation RT-PCR 52 ＋ p IHC 69 ＋ p 6 5 (83%) 1 <.05 21 14 (67%) 7 <.05 ±• 16 6 (38%) 10 三3b 2 8 (36%) 14 ＋ 30 5 (17%) 25 ~4 26 3 (12%) 23 • ±: CDH13 mRNA の有意な低下． 円 3: E-cadherin 蛋白の有意な低下， IHC ：免疫組織化学．-286-

成長ホルモン(GH)産生腺腫におけるDNAメチル化異常の解析

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