La presente Tesis titulada Identificación de perfiles ómicos para el diagnóstico y la monitorización del cáncer de vejiga se centra en la identificación de biomarcadores metabolómicos urinarios no invasivos para el diagnóstico y la monitorización del cáncer de vejiga (CaV). Con este fin, se han utilizado dos plataformas analíticas: la Resonancia Magnética Nuclear (Nuclear Magnetic Resonance, 1H NMR) y la Cromatografía Líquida de alta resolución acoplada a la Espectrometría de Masas (Ultraperformance Liquid Chromatography–Mass Spectrometry, UPLC-MS). Además, se han analizado tejidos vesicales mediante la técnica de Resonancia Magnética Nuclear de Alta Resolución con Giro de Ángulo Mágico (High-Resolution Magic Angle Spinning NMR, HRMAS NMR) para obtener más información sobre las vías metabólicas alteradas en el CaV y evaluar su relación con los perfiles metabólicos urinarios alterados. Por otro lado, se han realizado análisis transcriptómicos en tejidos vesicales para identificar genes metabólicos clave en el CaV. Finalmente, se han llevado a cabo estudios integradores con los datos metabolómicos y transcriptómicos para estudiar las conexiones entre genes y metabolitos y establecer su asociación con el metaboloma urinario.
Inicialmente, en el capítulo cuarto se presenta un perfil metabólico capaz de distinguir los tejidos tumorales de los tejidos no tumorales con una sensibilidad y especificidad del 100%, independientemente del estadio y el grado del tumor. Además, se muestran los metabolitos que forman parte de este perfil, así como las vías metabólicas alteradas asociadas a la carcinogénesis vesical. Por otro lado, tras la realización de análisis transcriptómicos en esos mismos tejidos, se detalla como los genes metabólicos están siendo regulados a la baja en los tumores de vejiga mediante la acción de represores transcripcionales, marcas de histonas y procesos de splicing alternativo. Además, mediante un análisis integrativo entre los datos metabolómicos y transcriptómicos, se muestra la concordancia entre los resultados obtenidos a través de estas dos técnicas que representan diferentes niveles de regulación molecular. Finalmente, se muestra un perfil metabólico urinario identificado mediante 1H NMR capaz de distinguir orinas con CaV de orinas control (recogidas después de la cirugía) con una significativa sensibilidad (90,9%) y especificidad (76,9%). Como las muestras de orina y de tejido se recogieron de los mismos pacientes, al final del capítulo se describen las conexiones encontradas entre las rutas metabólicas alteradas en tejidos y orinas
Los siguientes dos capítulos de la tesis se centran principalmente en la búsqueda de biomarcadores no invasivos de CaV en muestras de orina para el seguimiento de esta enfermedad a través de dos técnicas analíticas.
Con el objetivo de validar el perfil urinario como biomarcador de monitorización de CaV, se llevó a cabo un estudio con muestras urinarias adicionales de pacientes con CaV no músculo-invasivo (CVNMI). Las muestras urinarias se recogieron mensualmente durante un período de seguimiento activo. El perfil metabolómico urinario detectado mediante 1H NMR presentó sensibilidades y especificidades alrededor del 85% en la clasificación de las orinas tumorales, e incluso detectó las recidivas tumorales en un estado temprano de su desarrollo, anticipándose en algunos casos a la visualización de éstas mediante cistoscopia. Este quinto capítulo también detalla los metabolitos discriminantes que forman parte de este perfil metabolómico y su relación con las rutas bioquímicas alteradas en el CaV.
Finalmente, el sexto capítulo de la tesis muestra los resultados de un estudio clínico llevado a cabo con un gran número de muestras de orina recolectadas de pacientes con CVNMI antes y después de la cirugía, así como durante un periodo de seguimiento posterior. En este caso, las muestras urinarias se analizaron mediante UPLC-MS y se estudiaron las vías metabólicas perturbadas vinculadas al CaV. Algunas muestras de orina fueron comunes a las analizadas por 1H NMR, y en general, los datos de los dos estudios fueron concordantes. El análisis de las trayectorias longitudinales del biomarcador metabólico urinario capaz de discriminar las muestras tumorales de las controles permitió una evaluación preliminar de su utilidad como biomarcador de seguimiento para la detección de las recurrencias en pacientes con CVNMI.
En general, los resultados presentados en esta tesis respaldan la hipótesis de la existencia de una huella metabólica urinaria vinculada a las alteraciones tumorales presentes en los tejidos vesicales, capaz de detectar y predecir las recurrencias durante el período de vigilancia en pacientes con CVNMI. Además, los buenos resultados obtenidos y la concordancia entre ambos estudios urinarios (1H NMR y UPLC-MS) posicionan la metabolómica al frente de las técnicas ómicas para la búsqueda de biomarcadores robustos y dinámicos que reflejen la biología del tumor.The present Thesis entitled Identification of omic profiles for diagnosis and monitoring of bladder cancer is focused on identifying non-invasive urinary metabolomic biomarkers of diagnosis and monitoring of bladder cancer (BC). In order to achieve this objective, two analytical strategies based on Nuclear Magnetic Resonance (1H NMR) and Ultraperformance Liquid Chromatography–Mass Spectrometry (UPLC-MS) have been used for the analysis of urine samples. Besides, bladder tissue samples have been analyzed by High-Resolution Magic Angle Spinning NMR (HRMAS NMR) technique to get further insight into altered metabolic pathways in BC and assess their link with altered urinary metabolomic profiles. On the other hand, transcriptomic analysis has been carried out in bladder tissues to identify key metabolic genes in BC. Additionally, integrative studies using metabolomic and transcriptomic data have been performed to study the gene-metabolite networks in BC and its association with the altered urinary metabolome.
Initially, a metabolic profile able to distinguish BC tissues from non-tumor tissues with a sensitivity and specificity of 100%, independently of stage and grade of the tumor, is presented in chapter four. Moreover, the metabolites that take part of this profile are showed, as well as, the disturbed metabolic pathways linked to BC carcinogenesis. On the other hand, the transcriptomic analysis performed in these same tissues is described, indicating principally that metabolic genes are downregulated in bladder tumors and that transcriptional repressors, histone marks, and alternatively splicing processes may be regulating those genes. Additionally, an integrative analysis between metabolomic and transcriptomic data is detailed, showing concordance between the results obtained through these two techniques that represent different levels of molecular regulation. Finally, a 1H NMR-based urinary metabolic profile capable of distinguishing BC urines from control urines (collected after surgery) with significant sensitivity (90.9%) and specificity (76.9%) is shown. Urine and tissue samples were collected from the same patients, so at the end of chapter, the connections between the perturbed metabolic pathways in tissues and urines are described.
The following two chapters of the thesis are focused principally on searching non-invasive biomarkers of BC in urine samples for monitoring this disease by means of two analytical techniques.
In order to validate the urinary profile as a biomarker for monitoring, a study with additional urinary samples collected from patients with NMIBC was carried out. Urinary samples were collected monthly during a follow-up period. The urinary 1H NMR metabolic profile showed a sensitivity and specificity around 85% classifying BC urines. Moreover, tumor recurrences were detected by the metabolic profile in an early stage of disease, anticipating in some cases to the BC visualization by cystoscopy. The altered metabolic pathways in the urinary metabolome were also identified.
Finally, the sixth chapter of the thesis exhibits the results of an investigative clinical study carried out in a large number or urinary samples collected from NMIBC patients before and after surgery, as well as during the subsequent surveillance. In this case, the urine samples were analyzed through UPLC-MS and perturbed metabolic pathways were assessed. Some urinary samples were common to those analyzed by 1H NMR, and data were in agreement. The analysis of the longitudinal trajectories of the metabolic biomarker discriminating between BC and control samples allowed a preliminary evaluation of its potential utility to monitor NMIBC relapse in patients undergoing surveillance for tumor recurrence.
On the whole, the results presented in this thesis give support to the hypothesis of the existence of a urinary metabolic signature linked with tumor alterations in BC tissues able to detect and predict recurrences during the surveillance period of patients with NMIBC. Moreover, the good results obtained and the concordance between the urinary analyses by 1H NMR and UPLC–MS highlight the metabolomics as a competitive omic for searching biomarkers, since offers robust and dynamic information about the biology of the tumor
