Análisis de la expresión de miRNA circulantes en pacientes con infarto agudo de miocardio y su relación con citoquinas. Repercusión funcional en cultivos de células endoteliales humana.
Las enfermedades cardiovasculares, en concreto el síndrome coronario agudo (SCA), son la principal causa de muerte en hombres y mujeres en todo el mundo. El SCA es la manifestación clínica de la isquemia miocárdica, producida por la reducción del aporte sanguíneo al miocardio como consecuencia de una disminución del calibre de las arterias coronarias.
La enfermedad subyacente al SCA más frecuente es la aterosclerosis, un proceso inflamatorio iniciado por la acumulación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) en el espacio subendotelial en arterias de mediano y gran calibre a lo largo del sistema cardiovascular. El primer cambio funcional detectable en la lesión aterosclerótica es la disfunción endotelial provocada por la modificación mediante oxidación y agregación de las LDL que estimulan una respuesta inmune innata y adaptativa, dando lugar a la activación del endotelio.
El endotelio activado induce la expresión de moléculas de adhesión y quimioquinas, dando lugar a la adhesión de monocitos y a su migración a través de la pared vascular, donde se diferencian a macrófagos y células dendríticas. Conforme avanza el proceso inflamatorio, se genera una capa fibrosa, cuya rotura es la causa más frecuente de trombosis coronaria. El trombo puede ocluir parcial o totalmente la arteria coronaria, dando lugar a la isquemia miocárdica y necrosis del tejido perfundido por esa arteria. Como consecuencia de esta necrosis, se desencadena una respuesta inflamatoria sistémica inicial que posteriormente es suprimida, en parte, por citoquinas antiinflamatorias, dando lugar a la transición desde la inflamación a la reparación cardiaca. Por tanto, la inflamación ejerce un papel central en la fisiopatología del SCA.
La sintomatología clínica no permite una diferenciación precisa de los diferentes síndromes, por lo que es imprescindible la realización de un electrocardiograma (ECG), cuyos resultados permiten agrupar a los pacientes con SCA en dos grandes grupos: infarto agudo de miocardio con elevación del segmento ST (IAMCEST) y aquellos que no presentan una elevación del ST (SCA sin elevación del segmento ST, SCASEST). Éste último término (SCASEST) hace referencia tanto al infarto agudo de miocardio sin elevación del ST (IAMSEST) como a la angina inestable.
La necrosis de cardiomiocitos asociada al daño cardiaco provocado por el SCA da lugar a la liberación de proteínas a la circulación, como las troponinas I y T (cTnI y cTnT) que actualmente se utilizan como biomarcadores de necrosis miocárdica de referencia. Por lo tanto, en el diagnóstico de los diferentes síndromes, se complementa el resultado del ECG con la medida plasmática de cTnI o cTnT. De esta manera, los pacientes IAMCEST (elevación del segmento ST y con aumento de troponinas cardiacas) son diagnosticados con certeza y precocidad. La medida de las troponinas cardiacas es asimismo un aspecto importante en el diagnóstico de los pacientes IAMSEST, ya que no muestran una elevación del ST pero sí una elevación de troponinas en sangre. Sin embargo, su uso en el diagnóstico de pacientes con angina inestable no está tan claro, ya que no muestran elevación del ST y tampoco un aumento de troponinas dificultando un diagnóstico temprano.
Es probable que el tejido cardiaco dañado genere una liberación de RNA no codificantes (ncRNA), entre ellos microRNA (miRNA), similar a la liberación de troponinas cardiacas. Los miRNA son pequeñas moléculas monocatenarias (19-23 nt) de RNA no codificante que desempeñan importantes funciones en la regulación postranscripcional de la expresión génica.
El interés actual en los miRNA circulantes radica en la posibilidad de utilizarlos como biomarcadores clínicos para distintas enfermedades, entre ellas las cardiovasculares. Sin embargo, la falta de estandarización de los métodos pre-analíticos y analíticos, ha derivado en la imposibilidad de comparar los diferentes estudios publicados. El resultado de estas dificultades metodológicas es la falta de consenso sobre el potencial de los miRNA como biomarcadores de SCA.
El suero y el plasma son los tipos de muestra más frecuentemente utilizados en los estudios de expresión de miRNA circulantes. Sin embargo, el tipo de muestra de partida podría ser una fuente de variación en el análisis del perfil de miRNA circulantes en SCA. Por ello, el primer objetivo de este estudio ha sido determinar las diferencias en la concentración de miRNA en suero y plasma y si bien, la fracción de miRNA entre suero y plasma era similar, los pacientes con SCASEST presentaron concentraciones de miRNA más elevadas que las muestras de sujetos sanos.
Entre las dificultades metodológicas del análisis de la expresión de miRNA circulantes mediante qRT-PCR también se encuentra la normalización de los valores de expresión. Por ello, para seleccionar un control endógeno adecuado para nuestros estudios de qRT-PCR en muestras de suero y plasma de pacientes con SCASEST e individuos sanos, analizamos la expresión de los miRNA circulantes utilizados como controles endógenos en diferentes estudios. El miR-484 resultó ser el miRNA que, además de no mostrar diferencias significativas entre suero y plasma en nuestra muestra, tampoco mostró diferencias en los coeficientes de variación. Por lo tanto, los valores de expresión de los miRNA de este estudio fueron normalizados tomando como referencia la expresión de miR-484.
Por otra parte, suero o plasma podrían influir en el nivel de expresión de miRNA circulantes en pacientes con SCA y para determinarlo, analizamos la expresión de miRNA que previamente habían sido descritos como posibles biomarcadores de SCA. De hecho, el patrón de expresión de los miRNA resultó ser diferente en suero y plasma y también se observaron diferencias en la variabilidad de expresión. El suero ofreció una mayor sensibilidad en la detección de miRNA y una menor variabilidad en la expresión, sugiriendo que el tipo de muestra más adecuado para realizar estudios de miRNA circulantes en pacientes con SCA es el suero.
La desregulación de la biogénesis de miRNA se ha asociado a diversas enfermedades cardiovasculares. Numerosos estudios han descrito diferentes patrones de expresión de miRNA en el SCA, especialmente en pacientes IAMCEST, sugiriendo su posible uso como herramientas moleculares para su diagnóstico y pronóstico. Sin embargo, debido a la mayor incertidumbre a la hora de diagnosticar pacientes con SCASEST (IAMSEST y angina inestable), el análisis del patrón de expresión de miRNA circulantes en este tipo de pacientes sería de especial interés, siguiente objetivo de este estudio. Para ello, mediante arrays de expresión analizamos el perfil de miRNA de pacientes con SCASEST en su manifestación aguda y también después de un año de evolución clínica, para determinar los miRNA relacionados directamente con el momento agudo del infarto. Se observó una desregulación de 54 miRNA en el momento agudo del SCA, de los que 10 aumentaron y 44 disminuyeron su expresión. Después de un año de evolución clínica, había 42 miRNA desregulados, de los que 35 aumentaron y 7 disminuyeron su expresión.
Con la finalidad de identificar los miRNA que podrían estar relacionados con el momento agudo del infarto, se seleccionaron del array aquellos miRNA cuya expresión variaba en la manifestación aguda del SCA y revertía a niveles control después de un año de evolución clínica. Estos miRNA se comprobaron posteriormente en una población de SCASEST más amplia y se confirmó la desregulación de la expresión de let-7e, miR-28, miR-130b, miR-523, miR-874, miR-92a, miR-26a y miR-320b en suero de pacientes con SCASEST en su manifestación aguda. De ellos, la expresión de let-7e y miR-26a revirtió hasta niveles control tras un año de evolución clínica.
El miRNA let-7e forma parte del cluster miR-99b/let-7e/miR-125a y para comprobar si estos miRNA se comportaban de manera coordinada, también analizamos la expresión de miR-99b y miR-125a. Al igual que let-7e, la expresión de miR-99b y miR-125a disminuyó en suero de pacientes con SCASEST en su manifestación aguda, revirtiendo a niveles control después de un año de evolución clínica.
La comunicación intercelular a través de miRNA circulantes es especialmente importante para las células endoteliales, donde se ha descrito una alta expresión del cluster miR-99b/let-7e/miR-125a. Sin embargo, se desconoce su papel en la biología vascular. Por ello, después de comprobar los niveles circulantes del cluster miR-99b/let-7e/miR-125a en pacientes con SCASEST, estudiamos su implicación en la modulación de la función endotelial en cultivo celular. Para ello, utilizando células endoteliales de vena umbilical humana, HUVEC, se realizaron transfecciones con inhibidores y mímicos de los 3 miRNA del cluster, analizando su capacidad funcional mediante estudios de adhesión, proliferación y vasculogénesis. Sólo el let-7e y miR-125a tuvieron efectos sobre la función endotelial. Las células transfectadas con el mímico de let-7e incrementan su capacidad de adhesión y con el inhibidor de let-7e aumentan la vasculogénesis, mientras que la transfección celular con el inhibidor de miR-125a disminuye la proliferación celular.
También se ha demostrado la contribución de los miRNA en gran variedad de procesos biológicos incluyendo la disfunción endotelial y la inflamación vascular, y la inflamación tiene un papel destacado en la patogénesis del SCA. Un mediador clave de la inflamación es el factor de transcripción nuclear NF-κB, el cual se activa en respuesta a estímulos inflamatorios e induce la expresión de genes inflamatorios como moléculas de adhesión y citoquinas proinflamatorias. La activación de NF-κB también regula la expresión de miRNA que a su vez pueden controlar la inflamación regulando esta vía de señalización. Además, los miRNA pueden regular postranscripcionalmente factores inflamatorios como citoquinas o moléculas de adhesión tanto de forma directa como indirecta. Para determinar si la expresión de miRNA circulantes relacionados con el SCA estaban asociados a los niveles de citoquinas pro y antiinflamatorias y de quimioquinas implicadas en la patología del SCA se realizó un análisis de correlación en todos los individuos del estudio. Como resultado, la expresión de todos los miRNA previamente relacionados con la manifestación aguda del SCA, excepto el miR-125a, mostraron una asociación con los niveles de citoquinas y quimioquinas implicadas en la patología del SCA.
Los resultados obtenidos en la presente tesis destacan la importancia del tipo de muestra de partida al analizar la expresión de miRNA circulantes y se sugiere el suero como la muestra adecuada en pacientes con SCA, así como el miR-484 como control endógeno. Por primera vez se analiza el perfil de expresión de miRNA circulantes en pacientes con SCASEST en su manifestación aguda y después de un año de evolución clínica y se han identificado varios miRNA circulantes que podrían actuar como posibles biomarcadores de SCASEST. Entre ellos, dos de los componentes del cluster miR-99b/let-7e/miR-125a también se han visto implicados en la modulación de la función endotelial. Finalmente, la asociación existente entre la expresión de los miRNA relacionados con el SCASEST y los niveles séricos de citoquinas y quimioquinas implicadas en la patología del SCA, refuerza su posible uso como biomarcadores de SCASEST.Cardiovascular diseases, specifically acute coronary syndrome (ACS), are the leading cause of death in the world for both men and women. ACS is the clinical manifestation of myocardial ischemia, caused by myocardial blood flow decrease as a result of reduced coronary artery size.
Atherosclerosis is the most common underlying disease of ACS, an inflammatory disease primarily driven by low density lipoprotein (LDL) accumulation in the subendothelial layer of large and medium-sized arteries along the cardiovascular system. Endothelial dysfunction appears as the first functional change in atherosclerotic lesions, due to LDL modification and aggregation, and the resulting stimulation of the innate and adaptive immune response, giving rise to endothelial activation.
Vascular endothelial cell activation induces cell adhesion molecule and chemokine expression, leading to monocyte adhesion and transmigration across the vascular wall, where monocytes differentiate into macrophages and dendritic cells. Both cell types can serve as deposits of lipids and become foam cells. As the inflammatory process advances, a fibrous cap is formed, whose rupture is the most frequent cause of thrombosis. The thrombus may partially or totally occlude the coronary artery, resulting in myocardial ischemia and necrosis. As a consequence, a systemic inflammatory response is triggered and subsequently partially suppressed by anti-inflammatory cytokines, resulting in a transition from inflammation toward cardiac repair. Therefore, inflammation has a central role in ACS pathophysiology.
Clinical symptoms caused by ACS do not permit an accurate differentiation between distinct syndromes, making essential to get an electrocardiogram (ECG). Patients with ACS are divided into two major categories based on the ECG results: ST-segment elevation myocardial infarction (STEMI) patients and non-ST-segment elevation ACS (NSTE-ACS). The latter term (NSTE-ACS) encompasses both non-ST elevation myocardial infarction (NSTEMI) and unstable angina.
Cardiomyocyte necrosis is associated to myocardial damage caused by ACS, leading to a protein release into the circulation such as cardiac troponin I and T (cTnI and cTnT), biomarkers of myocardial necrosis currently used. Thus, ACS diagnosis requires the ECG result in conjunction with the traditional markers cTnI or cTnT. STEMI patients (ST elevation and troponin-positive) are diagnosed, therefore, in an early and more accurate manner. The measurement of cardiac troponins is also an important aspect for the diagnosis of NSTEMI (non-ST elevation and troponin-positive). However, the diagnosis of unstable angina patients is hampered because they are negative to cardiac troponin and present non-ST elevation.
It is likely that the damaged heart tissue causes a release of non-coding RNAs (ncRNAs), including microRNAs (miRNAs), analogous to the release of cardiac troponins. miRNAs are small single-stranded molecules (19-23 nt) that functions as important post-transcriptional regulators of gene expression.
The increasingly recent interest in circulating miRNAs lies in their potential use as clinical biomarkers for multiple diseases, especially cardiovascular diseases. However, the lack of a methodological standardization has led to the inability of comparison between different studies. These methodological issues result in a lack of consensus about the potential use of miRNAs as ACS biomarkers.
Serum and plasma are the most widely used type of sample in studies of circulating miRNA expression. Nevertheless, the sample of choice could be a source of variation and influence the analysis of circulating miRNA expression in ACS. For that reason, we initially determined the differences in miRNA enrichment and yield in serum and plasma, and while no differences were found when miRNA fraction between serum and plasma were compared, the miRNA concentration in both sample types in NSTE-ACS patients was higher than in healthy subjects.
Among the methodological challenges in analyzing miRNA expression by qRT-PCR is data normalization. In this regard, we examined the most frequently used miRNA as endogenous controls, to stablish an appropriate endogenous control to be used in the qRT-PCR studies performed in both serum and plasma of NSTE-ACS patients and healthy subjects. miR-484 showed no significant differences between means and coefficients of variation in both serum and plasma. Therefore, in this study the values of miRNAs were normalized to the expression of miR-484.
On the other hand, to determine the influence of serum and plasma on circulating miRNA profile expression in NSTE-ACS patients, we analyzed the expression of the most described miRNAs as potential biomarkers of ACS. Indeed, serum and plasma showed a different miRNA expression pattern and a significant difference in variance was also found. Serum demonstrated a higher sensitivity and lower variability in miRNA expression, suggesting that serum may be the appropriate sample type in circulating miRNA studies.
Dysregulation of miRNA biogenesis has been associated with many cardiovascular diseases. Several studies have shown different circulating miRNA profile expression in ACS, particularly in STEMI patients, suggesting their potential use as a molecular tool for the diagnosis and prognosis of ACS. However, the analysis of the miRNA profile expression would be of particular interest in NSTE-ACS patients (NSTEMI and instable angina) because of the higher uncertainty in the diagnosis, and thus it was the following aim of this study. For that purpose, we assessed the miRNA expression in patients with acute manifestation of NSTE-ACS and one-year follow-up, to select the miRNAs related to ACS. 54 miRNAs were dysregulated in ACS, including 10 up-regulated and 44 down-regulated miRNAs. After one-year follow-up, 42 miRNAs were dysregulated, including 35 up-regulated and 7 down-regulated miRNAs.
In order to identify miRNAs involved with acute manifestation of ACS, we selected those miRNAs dysregulated in NSTE-ACS patients whose expression reverted to control levels after one-year follow-up. Changes in miRNA expression of let-7e, miR-28, miR-130b, miR-523, miR-874, miR-92a, miR-26a and miR-320b were then confirmed in serum of a larger number of NSTE-ACS patients. Among then, let-7e and miR-26a expression was reverted to control levels after one-year follow-up.
Let-7e miRNA is a member of miR-99b/let-7e/miR-125a cluster, so in order to assess if the cluster is expressed coordinately, we also determined miR-99b and miR-125a expression. miR-99b and miR-125a were down-regulated in NSTE-ACS patients in the same way that let-7e, reversing to control levels after one-year follow-up.
Intercellular communication involving circulating miRNAs is especially relevant to endothelial cells, where the cluster miR-99b/let-7e/miR-125a is highly expressed. However, its role in vascular biology is unknown. In this regard, after confirming the cluster miR-99b/let-7e/miR-125a expression in NSTE-ACS patients, we studied its involvement in endothelial function. We cultured human umbilical vein endothelial cells, HUVEC, and we analyze the adhesion, proliferation and vasculogenesis capacity of cells transfected with miRNA inhibitors and mimics of the cluster constituents, assessing the endothelial function. Endothelial function was only affected by let-7e and miR-125a transfection. HUVEC transfected with let-7e mimic and let-7e inhibitor show an increased adhesion capacity and an increased vasculogenesis capacity, respectively, whereas miR-125a transfection decrease HUVEC proliferation.
Great diversity of biological processes has been demonstrated to be affected by miRNAs, including endothelial dysfunction and vascular inflammation, and inflammation has a leading role in ACS pathogenesis. The NF-κB transcription factor is a key mediator of inflammation, being activated in response to inflammatory stimulus, and leading to the induction of adhesion molecule and proinflammatory cytokine expression. NF-B activation also regulates miRNA expression, which in turn can regulate inflammation through modulation of NF-κB signaling pathway. miRNAs can also directly and indirectly control cytokine and adhesion molecule expression in a post transcriptional manner. To determine the association between circulating miRNAs related to ACS and pro and anti-inflammatory cytokine levels involved in ACS, we performed a correlation analysis considering all the participants in the study. As a result, miRNA expression of every miRNA previously selected regarding to ACS manifestation, excluding miR-125a, was related to the levels of cytokine and chemokine implicated in ACS.
In conclusion, our results highlight the importance of the sample of choice for detecting circulating miRNA expression, suggesting that serum may be the appropriate sample type and miR-484 could be used as reference gene in circulating miRNA studies of NSTE-ACS. The obtained results provide for the first time the circulating miRNA profile in NSTE-ACS patients at acute manifestation and after one-year follow-up, identifying several miRNAs as potential biomarkers of NSTE-ACS. Among them, two components of miR-99b/let-7e/miR-125a cluster has been implicated in the modulation of endothelial function. Finally, the association between the expression of miRNAs related to NSTE-ACS and cytokine and chemokine serum levels involved in ACS enhance the potential use of miRNAs as NSTE-ACS biomarkers
