En Biomedicina, particularmente en el campo de reproducción humana asistida, la mejora de las técnicas implícitas, así como la puesta a punto de otras, requiere de la realización de estudios y ensayos previos con pre-embriones, preferiblemente de la misma especie, con potencial de desarrollo y que sean genéticamente normales. La disponibilidad y uso de estos pre-embriones no debe provocar conflictos éticos ni legales, no siendo, los pre-embriones humanos generados con una finalidad reproductiva la opción más inmediata.
En la búsqueda de modelos pre-embrionarios humanos válidos, homólogos a aquéllos reproductivamente viables, presentamos el presente trabajo de tesis, cuyo objetivo principal es obtener blastocistos diploides heteroparentales a partir de pre-embriones humanos tripronucleares, procedentes de fecundación in vitro convencional (FIV), y microinyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) que, por resultar de una fecundación anómala, son no viables y por tanto, descartados de los procedimientos de reproducción asistida. La obtención de blastocistos diploides heteroparentales a partir de pre-embriones humanos tripronucleares procedentes de FIV se realizará mediante la eliminación microquirúrgica del pronúcleo supernumerario y los procedentes de ICSI mediante el proceso de autocorrección embrionaria tras el cultivo y estudio morfocinético de éstos.
Tras hacer un estudio exhaustivo de la ploidía y composición parental en los pre-embriones tripronucleares procedentes de cada una de las técnicas de fecundación in vitro (FIV e ICSI) observamos que, pese a que la capacidad para desarrollarse in vitro hasta el estadio de blastocisto es similar en ambos grupos, su composición cromosómica (ploidía) es dependiente del procedimiento de fecundación que les dio origen. Así, los pre-embriones tripronucleares procedentes de FIV presentan una capacidad muy limitada para autocorregirse, debido a su origen diándrico, ya que estos pre-embriones tripronucleares, además del pronúcleo extra, presentan un centriolo adicional que da lugar a segregaciones cromosómicas caóticas en sucesivas divisiones de segmentación. En este grupo de cigotos tripronucleares, fue necesario poner a punto, desarrollar y validar la técnica de epronucleación selectiva, mediante la cual, el pronúcleo paterno y el centriolo extra fueron eliminados, logrando obtener blastocistos diploides y heteroparentales.
Por otro lado, los pre-embriones tripronucleares procedentes de ICSI, mostraron la capacidad de autocorregirse hacia la diploidía y heteroparentalidad a lo largo del desarrollo in vitro. En este grupo de pre-embriones tripronucleares realizamos un estudio morfocinético exhaustivo de su desarrollo in vitro desde el estadio de cigoto hasta el estadio de blastocisto en tiempo real, observando que, los parámetros morfocinéticos de aquellos pre-embriones tripronucleares que se autocorregían hacia la diploidía fueron similares a aquéllos propios de los pre-embriones diploides control y diferentes de los pre-embriones tripronucleares persistentemente triploides. Con estos datos pudimos establecer un modelo matemático predictivo de la diploidía, dependiente de la variable t5, es decir del tiempo de división a 5 células.
De este trabajo de investigación concluimos que, es posible obtener blastocistos diploides heteroparentales a partir de pre-embriones tripronucleares no viables, procedentes de FIV e ICSI, previa micromanipulación y cultivo (respectivamente), quedando validados como modelos biológicos para investigación en Biomedicina y quedando tal vez, para un futuro, como una posible opción reproductiva para casos muy particulares de infertilidad.Biomedicine, particularly in the field of human assisted reproduction, the improvement of implied techniques, as well as the development of other, requires studies and preliminary tests using pre-embryos, preferably of the same species, provided with development potential and genetically normal. The availability and use of these pre-embryos may not cause ethical or legal disputes, not being, human pre-embryos generated with a reproductive purpose the immediate option.
In the search for homologous to those valid reproductively viable human pre-embryo models, we presented this thesis. The main objective is to obtain heteroparental diploid blastocysts from human tripronucleated pre-embryos, from conventional in vitro fertilization (IVF) and intracytoplasmic sperm injection (ICSI) which, result from abnormal fertilization, are not viable and therefore discarded from assisted reproduction procedures. Obtaining diploid and heteroparental tripronucleated blastocysts from human pre-embryos from IVF will be through the microsurgical removal of supernumerary pronucleus and those from ICSI embryo through the process of self-correction after culture and morphokinetic study of them.
After an exhaustive study of ploidy and parental composition in tripronucleated pre-embryos from each of the techniques of in vitro fertilization (IVF and ICSI), it was observed that, although the ability for growing in vitro to the blastocyst stage is similar in both groups, ploidy is dependent on the fertilization procedure that gave rise them. Thus, tripronucleated pre-embryos from IVF have a very limited ability to be self-corrected, due to its diandric origin, as these tripronucleated pre-embryos present an additional centriole in addition to the extra pronucleus, resulting in chaotic chromosomal segregation along the successive cleavage divisions. In this group of tripronucleated zygotes it was necessary to develop and validate the technique of selective epronucleation, whereby, the paternal pronucleous and extra centrioles were eliminated, obtaining diploid and heteroparental blastocysts.
Furthermore, tripronucleated pre-embryos coming from ICSI, showed the ability to be self-corrected to diploidy and heteroparentality along the in vitro development. In this group of tripronucleated pre-embryos we performed a morphokinetic comprehensive study of in vitro development from the zygote to the blastocyst stage in real time, noting that the morphokinetic in those tripronucleated pre-embryos that were self-corrected to diploidy were similar to those typical of the diploid control pre-embryos and different from triploid tripronucleated pre-embryos. With this data we could establish a predictive mathematical model of diploidy dependent of the variable t5, ie time division to 5 cells.
From this research we conclude that it is possible to obtain diploid and heteroparental blastocysts from tripronucleated not viable pre-embryos from IVF and ICSI, after micromanipulation and culture (respectively), being them validated as biological models for biomedical research and being such instead, for a future as a possible reproductive choice for very special cases of infertility
