En aquest treball s’ha estudiat la presència d’enterobacteris en productes vegetals frescos que poden consumir-se directament, sense tractaments que poden afectar a la viabilitat dels microorganismes presents en aquests vegetals. Com material d’estudi s’han seleccionat una sèrie de verdures i hortalisses que habitualment poden consumir-se crues (tomates, enciams, rúcula, canonges, etc.), adquirides en distints establiments de la ciutat de València i els seus voltants, ja que la zona de l’horta de València es caracteritza, a més de per la qualitat i quantitat de la producció hortícola, per l’ús de pràctiques agrícoles (com l’ús de fem com adob) que afavoreixen la contaminació dels vegetals amb bacteris d’origen animal. Hi ha que indicar també que l’estudi s’ha realitzat tant amb verdures i hortalisses cultivades de manera estàndard o convencional (no ecològica), com amb productes ecològics o orgànics, i també amb vegetals processats (rentats, tallats i envasats) llestos per consumir directament (quarta gamma). S’han analitzat un total de 230 mostres de distints grups de vegetals: (i) 90 mostres de productes vegetals frescos cultivats mitjançant tècniques habituals (estàndard o convencional), (ii) 50 mostres de vegetals orgànics cultivats mitjançant mètodes ecològics, (iii) 60 mostres de productes vegetals de quarta gamma (tallats, processats, empaquetats i comercialitzats llestos pel consum), i (iv) 30 mostres d’amanides preparades en cuina, amb distints ingredients, i servides al consumidor.
Els distints vegetals analitzats van ser: tomates de diferents tipus (pera i redona convencional i ecològica) (50 mostres), enciams de diferents tipus (romana, iceberg, ecològic romana, i fulles roges i iceberg de quarta gamma) (60 mostres), cogollos (10 mostres), rúcula (quarta gamma i ecològica) (30 mostres), carlota (estàndard i ecològica) (20 mostres), canonges (quarta gamma) (20 mostres), i cogombre (estàndard) (10 mostres). Les mostres van ser adquirides en distints establiments de la ciutat de València i els voltants, tant en supermercats, fruiteries, i tendes especialitzades en productes ecològics. Les mostres d’amanida es van obtenir de menjadors escolars de dos centres educatius (20 mostres) i d’establiments de menjar per emportar (10 mostres).
Els resultats que es van obtenir en quant al NMP de coliformes en les mostres analitzades indiquen que aproximadament un 60% de totes les mostres estan contaminades amb bacteris coliformes, sent aquest percentatge qualitatiu major en les amanides (90%) i els productes de quarta gamma (75% de mostres contaminades), seguit dels productes ecològics (54%) i dels productes vegetals estàndard (42%). Les mostres que van mostrar un major contingut o càrrega de coliformes (superior a 2.400 per gram) van ser també les amanides (27%) i els productes de quarta gamma (20%), seguits dels productes estàndard (12%) i dels ecològics (4%), sent la mitjà total del 14% (Taula 1 i Annex I).
En quant a les espècies identificades (195 aïllats totals), la major part correspon a bacteris coliformes (gèneres Escherichia, Enterobacter, Citrobacter i Klebsiella), amb un total de 142 aïllats (73%), mentre que la resta són altres espècies d’enterobacteris (Pantoea, Serratia, Kluyvera, Hafnia i Leclercia) amb 45 aïllats (23%), i també es van identificar algunes espècies Gram-negatives que no pertanyen a la família dels enterobacteris (Pseudomonas, Stenotrophomonas, Flavimonas i Acinetobacter) (8 aïllats, 4%). Els percentatges d’aïllats que pertanyen a aquests grups (coliformes, altres enterobacteris, i altres Gram-negatius no enterobacteris) van ser similars en les mostres vegetals estàndard (80,6%, 16,1% i 3,2%, respectivament, amb un total de 62 aïllats), vegetals de quarta gamma (74,6%, 15,8% i 9,5%, respectivament, amb un total de 63 aïllats), amanides (87,9%, 12,1% i 0%, respectivament, amb un total de 33 aïllats), mentre que en els productes ecològics el grup majoritari d’aïllats va correspondre als enterobacteris no coliformes (56,7%), sent els coliformes el 43,2% dels aïllats (amb un total de 37 aïllats).
L’espècie més freqüentment aïllada en totes les mostres és Enterobacter cloacae, majoritària en els vegetals estàndard (47%), de quarta gamma (46%) i amanides (39%), mentre que en els productes vegetals ecològics l’espècie més freqüent és Pantoea agglomerans (24%). A continuació, com espècies més freqüents trobem Klebsiella oxytoca (13% dels aïllats totals), P. agglomerans (8,7%), Klebsiella peumoniae (5,6%), Serratia marcescens (6%), Enterobacter sakazakii (actualment Cronobacter spp.) (4,1%), Kluyvera ascorbata (3%), Citrobacter freundii (3%), Enterobacter aerogenes (2,5%), Flavimonas oryzihabitans (2,05), Hafnia alvei (2%), Escherichia coli (2%), Enterobacter cancerogenus (2%), Enterobacter gergoviae (1%), Kluyvera cryocrescens (1%), Pseudomonas putida (1%), Serratia plymuthica (1%), Acinetobacter baumannii (0,5%), Escherichia vulneris (0,5%), Leclercia adecarboxylata (0,5%), Serratia rubidaea (0,5%) i Stenotrofomonas maltophilia (0,5%).
En aquest estudi no s’han detectat bacteris patògens, com E. coli O157:H7 (encara que els quatre aïllats identificats com E. coli no es van caracteritzar a nivell de soca), Salmonella i Shigella. No obstant, la presència en els vegetals frescos, que són ingerits preferentment crus pel consumidor, de bacteris patògens oportunistes, presents com microbiota epifítica pròpia del vegetal, o com contaminants procedents del sòl o de fonts d’origen animal o humà, pot representar un risc potencial d’infecció pel consumidor, especialment si està immunodeprimit o debilitat.
Com conseqüència dels resultats exposats a l’apartat anterior, el segon objectiu d’aquesta tesi ha abordat la determinació de la presència de bacteris resistents als antibiòtics, que encara sent poc perillosos pel consumidor pel seu caràcter no patogen (o per la baixa càrrega microbiana dels vegetals), poden contribuir, una vegada ingerits, a la disseminació de les resistències entre la microbiota del consumidor, i per tant, en la comunitat.
Com antibiòtics elegits per detectar la presència de resistències s’han utilitzat onze agents quimioteràpics habitualment emprats en clínica pel tractament d’infeccions per bacteris Gram-negatius: ampicil•lina i amoxicil•lina/clavulànic (Augmentine) (dos antibiòtics del grup de les penicil•lines), ceftazidima i cefotaxima (cefalosporines de tercera generació), ciprofloxacino (agent del grup de les quinolones), estreptomicina i gentamicina (antibiòtics aminoglucosídics), cloramfenicol, nitrofurantoïna, clotrimoxazol (sulfametoxazol-trimetoprim) i tetraciclina. Aquest grup d’antibiòtics abasta molècules molt distintes entre sí, que pertanyen als principals grups d’antimicrobians efectius front a bacteris Gram-negatius, amb mecanismes d’acció molt variats i front als quals els bacteris poden desenvolupar també distints mecanismes de resistència.
Del total d’aïllats (n: 195), la majoria (74,8%) presenten resistència a l’ampicil•lina i també un percentatge alt són resistents a l’Augmentine (67,7%); les resistències a nitrofurantoïna són el 12,8%, a tetraciclina el 6,6% i a cefotaxima el 3,6%; les resistències a estreptomicina, clotrimoxazol, gentamicina, ceftazidima i cloramfenicol, són més baixes i estan al voltant del 1%. Cal destacar que cap aïllat va presentar resistència a ciprofloxacino.
Si fem referència a les multiresistències que presenten el total d’aïllats (n: 195), trobem que un 11,3% no presenten cap resistència. Presenten una única resistència el 29,2%, dos resistències el 43,6%, tres resistències el 9,2%, quatre resistències el 5,6% i el 1% són resistents a cinc antibiòtics. També cal ressaltar que del percentatge d’aïllats que presenten dos resistències, el 96,5% presenten resistència conjunta a ampicil•lina i a Augmentine, donat que són penicil•lines àmpliament usades i que els bacteris posseeixen mecanismes de resistència similars front a aquests antibiòtics. Cal destacar també que la majoria d’aïllats són resistents a antibiòtics àmpliament usats en clínica, tal com els beta-lactàmics amoxicil•lina/clavulànic i ampicil•lina, mentre que les resistències a cefalosporines de tercera generació (cefotaxima i ceftazidima), que han sigut usades d’una manera molt més limitada, són infreqüents. El nostre estudi és el primer que descriu la presència de resistències a antibiòtics clínicament rellevants en enterobacteris presents en productes vegetals frescos en Espanya, particularment en la fèrtil àrea de València, coneguda per la seva producció agrícola.
Els aliments vegetals frescos poden estar implicats en la transmissió d’espècies enteropatogèniques amb resistències. Varis factors expliquen aquest fenomen: (i) l’ús a escala industrial d’antibiòtics en ramaderia per a millorar la producció animal és molt important quantitativament, i (ii) l’ús de fem com adob agrícola, o el d’aigües contaminades amb matèria d’origen fecal com reg en plantacions agrícoles.
D’altra banda, els nostres resultats recolzen la idea de que la contaminació microbiana dels vegetals frescos amb patògens oportunistes tal com E. cloacae i K. pneumoniae, entre altres espècies, deu ser considerada com un problema de seguretat alimentària, especialment en persones debilitades o immunocompromeses per diferents causes, i també de que els productes vegetals frescos participen com a portadors de bacteris amb resistències des de les granges als consumidors. La presència de resistències a antibiòtics i particularment les multiresistències en espècies d’Enterobacter i Klebsiella i altres gèneres (Serratia, Pantoea, Kluyvera, Flavimonas, Hafnia, Citrobacter, Acinetobacter, Escherichia i Pseudomonas) en productes vegetals frescos recolza la seva utilitat per a servir com (i) indicadors de la disseminació de les resistències en el medi ambient, així com (ii) portadors de determinants de resistència des de les granges als consumidors, cosa que probablement contribueix a la disseminació de resistències a la microbiota comensal i/o patogènica a través de mecanismes de transferència horitzontal de gens. Aquesta qüestió hauria de ser considerada com un problema “silenciós” de seguretat alimentària, ja que en la majoria de casos no afecta directament a la salut del consumidor (no causa malaltia o símptomes) però pot contribuir al problema creixent de les resistències als antibiòtics en bacteris Gram-negatius. A més, els nostres resultats posen de manifest que seria molt útil incloure els productes vegetals frescos dintre de programes de vigilància epidemiològica per analitzar la disseminació de resistències bacterianes en el medi ambient i en la comunitat, fora de l’entorn hospitalari
