Algunas bacterias del ácido láctico (BAL) sintetizan exopolisacáridos (EPS) que mejoran las propiedades reológicas de alimentos fermentados, lo que despierta su interés industrial. Además, algunos de ellos han demostrado poseer propiedades beneficiosas para la salud (antitumorales, inmunomoduladoras, hipocolesterolémicas o prebióticas) y, por tanto, son buenos candidatos para la elaboración de alimentos funcionales. Entre los EPS, los dextranos son sintetizados por especies de los géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus, Streptococcus y Weisella de forma constitutiva o inducible. Sin embargo, poco se conoce sobre la regulación de la expresión de los genes dsr, que codifican las proteínas que los sintetizan, las dextransacarasas.
El presente trabajo de tesis doctoral se ha centrado en la caracterización a nivel molecular, fisiológico, metabólico y fisicoquímico de los EPS producidos por Lactobacillus sakei MN1 (EPS-LS) y Leuconostoc mesenteroides RTF10 (EPS-LM), dos BAL aisladas de productos cárnicos. También ha contemplado el estudio de la funcionalidad biológica de dichos polímeros, como agentes antivirales e inmunoestimulantes y el análisis del potencial de Lb. sakei MN1 como probiótico frente a patógenos de peces.
En primer lugar, se ha determinado que ambas cepas, en presencia de sacarosa como fuente de carbono, producen homopolisacáridos tipo dextrano con enlaces α-(1-6) en su cadena principal y un 3 % (EPS-LS) o un 9 % (EPS-LM) de ramificaciones con enlaces α-(1-3). Dichos polisacáridos se encuentran asociados a la pared celular o rodeando a las células, según se ha observado por microscopía electrónica.
Como resultado del estudio genético, se ha demostrado que los determinantes genéticos responsables de la producción del EPS-LS y el EPS-LM, se encuentran localizados en los plásmidos denominados pMN1 (13,7 kpb) y pRTF10 (20,6 kpb), respectivamente. Además, la determinación de la secuencia completa de nucleótidos de pMN1 (11.126 pb) ha revelado que pertenece a una familia de plásmidos que replican por el mecanismo de tipo theta, cuyo prototipo es pUCL287, y que contiene un replicón (el origen de replicación y los genes repA y repB), el gen dsrLS y 7 marcos de lectura abierta. También, se ha estudiado la expresión del gen dsrLS a nivel transcripcional y los resultados obtenidos indican que la dextransacarasa DsrLS se sintetiza a partir de dos transcritos: uno monocistrónico y otro policistrónico, que incluye los genes repA, repB y dsrLS. Además, se ha comprobado que la expresión de ambos mRNAs no se ve incrementada en presencia de sacarosa en el medio de cultivo. Por tanto, esta hexosa no es un agente inductor de la expresión de DsrLS siendo este el primer caso descrito de expresión sincronizada de una dextransacarasa y de la maquinara replicativa de un plásmido. El análisis bioinformático del producto de dsrLS ha revelado que codifica un péptido de 1.767 aminoácidos con una masa molecular de 190.039 Da y que contiene un péptido líder en su extremo amino terminal, lo que indica que DsrLS debe ser una proteína extracelular. Los modelos de la estructura 3D de DsrLS, basados en homología de aminoácidos y de conformación estructural, indican que es un enzima dimérico cuyo sustrato es la sacarosa y que posee actividad dextransacarasa.
Cultivos de Lb. sakei MN1 y Lc. mesenteroides RTF10 crecidos en medio definido han sido utilizados para la producción de EPS-LS y EPS-LM, respectivamente. Los polímeros han sido purificados a partir de los sobrenadantes de los cultivos por precipitación con etanol, dialisis y fraccionamiento cromatográfico con una recuperación de los mismos del 80 % y con un grado de pureza del 99 %. Ambos EPS han mostrado actividad antiviral in vitro frente a la infección por dos virus de salmónidos: el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (VNHI) y el virus de la necrosis pancreática infecciosa (VNPI). Además, se ha comprobado que el EPS-LS in vivo posee actividad antiviral y actúa como un agente estimulante de la respuesta inmune de truchas arcoíris (Oncorhynchus mykiss).
Por otro lado, Lb. sakei MN1 ha mostrado in vitro la capacidad de agregarse y formar biopelículas cuando crece en presencia de glucosa (no produce dextrano), pero no en presencia de sacarosa, cuando el dextrano es sintetizado por la bacteria. Este comportamiento ha sido validado in vivo utilizando un modelo de larvas gnotobióticas de pez cebra (Danio rerio). Además, este modelo ha permitido demostrar que Lb. sakei MN1 colonizada el intestino de las larvas y es capaz de competir con el patógeno de peces Vibrio anguillarum.
Por todo lo expuesto, tanto Lb. sakei MN1 por su potencial probiótico, como el EPS-LS que produce, por su acción inmunomoduladora y antiviral, resultan muy prometedores para su aplicación en el desarrollo de piensos funcionales para salmónidos.Some lactic acid bacteria (LAB) synthesize exopolysaccharides (EPS) that improve the rheological properties of fermented foods, which is of interest to the food industries. Moreover, some EPS have demonstrated beneficial health properties, such as antitumor, immunomodulatory, hypocholesterolemic or prebiotic activities. Thus, LAB are good candidates for the development of functional foods. Among the EPS, dextrans have various industrial applications outside of the food sector. It is known that these EPS are synthesized by species of the genera Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus, Streptococcus and Weisella. However, little is known about the regulation of expression of the dsr genes, which encode the dextransucrases that synthesise dextrans.
The present doctoral work has characterized at the molecular, physiological, metabolic and physicochemical levels, two EPS: EPS-LS and EPS-LM produced respectively by Lactobacillus sakei MN1 and Leuconostoc mesenteroides RTF10, both isolated from meat products. The biological functionality of these polymers as antiviral agents and immunostimulants, as well as the potential of the Lb. sakei MN1 as a probiotic against fish pathogens, has been investigated.
The physiological and physicochemical studies revealed that in the presence of sucrose as carbon source Lb. sakei MN1 and Lc. mesenteroides RTF10 produce dextrans with α-(1-6) linkages in their main chain and 3% (EPS-LS) or 9% (EPS-LM) of branches with α- (1-3) linkages. Analysis by electron microscopy showed that the EPS are associated with the cell wall or cells surrounding.
A further study showed that the genetic determinants for the production of EPS-LS and EPS-LM, are located respectively in the pMN1 (13.7 kbp) and the pRTF10 (20.6 kbp) plasmids. Furthermore, the determination of the complete nucleotide sequence of pMN1 (11,126 bp) revealed that it belongs to a family of plasmids which replicate by the theta type mechanism and whose prototype is pUCL287. The plasmid carries a replicon (the origin of replication and the repA and repB genes), the dsrLS gene and 7 open reading frames. Analysis of the dsrLS gene expression at the transcriptional level showed that the dextransucrase DsrLS is synthesized from two transcripts: one monocistronic and other polycistronic including repA, repB and dsrLS. As far as we know, this is the first instance of synchronised expression of a dextransucrase and the machinery of plasmid replication. In addition, the expression of both mRNAs does not increase when sucrose is present in the growth medium, revealing that this hexose is not an inducer of DsrLS expression. Bioinformatic analysis of the dsrLS gene product revealed that it is a peptide composed of 1,767 amino acids with a molecular mass of 190,039 Da and that contains a leader peptide at its amino terminus, indicating that DsrLS is an extracellular protein. 3D models of DsrLS structure based on amino acid homology and structural conformation indicate that the protein is a dimeric enzyme, whose substrate is sucrose and which has dextransucrase activity.
Lb. sakei MN1 and Lc. mesenteroides RTF10 cultures grown in defined medium have been used for production of EPS-LS and EPS-LM. The polymers have been purified from the culture supernatants by ethanol precipitation, dialysis and chromatographic fractionation, with a recovery of 80% and with a purity of 99%. Both dextrans have shown in vitro antiviral activity against infection by two salmonid viruses: infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) and Infectious pancreatic necrosis virus (IPNV). Furthermore, it has been demonstrated that EPS-LS has antiviral activity in vivo, and acts as an immunostimulant of the immune response of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss).
Furthermore, it was shown that in vitro Lb. sakei MN1 has the ability to aggregate and to form biofilms when grown in the presence of glucose but not in the presence of sucrose, condition in which produces dextran. This behaviour has been validated by use of a gnotobiotic zebrafish (Danio rerio) larva model. Moreover, this model has demonstrated that Lb. sakei MN1 colonizes the larval intestine and it is able to compete in this habitat with the fish pathogen Vibrio anguillarum.
For all the above mentioned reasons, both Lb. sakei MN1 for its probiotic potential as competitor with bacterial pathogens, and the EPS-LS for its immunomodulatory and antiviral activities, have potential application for the development of functional feed for salmonids
