Introducción: La artrosis es un proceso degenerativo articular que presenta una elevada prevalencia y que es un claro ejemplo de enfermedad de etiología compleja que resulta de la interacción de factores adquiridos con una predisposición hereditaria. NF-κB es un complejo proteico que controla la transcripción del ADN y que está implicado en la respuesta celular frente a diversos estímulos como el estrés, las citoquinas, o antígenos bacterianos o virales. Los microRNAs son pequeños RNAs no codificantes que regulan la expresión génica mediante la inhibición de RNA mensajeros . En la última década se han convertido en una diana de estudio los mecanismos epigenéticos que actúan en los procesos degenerativos artrósicos y en los fenómenos inflamatorios.
Material y métodos: Se realiza un estudio clínico de 27 pacientes sometidos a una artroplastia total de rodilla por osteoartritis sintomática. Posteriormente, se realizó a partir de las muestras de cartílago de tibia proximal obtenido de estos pacientes un estudio histológico, inmunohistoquímico y se elaboró un modelo experimental de cultivo de condrocitos.
Se elaboraron 3 cultivos independientes, uno control, otro estimulado con IL-1β y un tercero estimulado con IL-1β en ausencia y en presencia de un inhibidor de NF-κB denominado Parthenolide.
Sobre estos cultivos se determinó la expresión de NF-κB con Western-Blot, la expresión de mRNA34a y mRNA de NF-κB con qPCR-RT y finalmente la expresión de MCP-1 con ELISA.
Resultados: La edad media de los pacientes intervenidos fue de 70.03 años, siendo mujeres el 66.7% de los casos. El 51.9% de los pacientes presentaban como clínica fundamental dolor invalidante asociado a derrames de repetición con gran incapacidad funcional. El análisis del Knee-society-score muestra una puntuación media obtenida de 19.85 puntos, mientras que el 70,4% de los pacientes presentaban un grado III de Albhäck. En el 70,04% de los pacientes, no existía una correlación clínico-radiográfica.
Histológicamente se aprecia como la pérdida de elasticidad del cartílago provoca una rotura de las fibras de colágena y la aparición de hendiduras, para posteriormente evolucionar a fracturas y finalmente en ulceraciones.
El estudio inmunohistoquímico pone de manifiesto una fuerte expresión en NF-κB a nivel del citoplasma de los condrocitos.
En los cultivos de condrocitos se observa como la IL-1β aumenta de forma considerable la expresión de NF-κB-p65, sin embargo el aumento de la forma fosforilada NF-κB-p-p65 es muy discreto y por tanto no hay activación de la misma en estas células.
De la misma manera, tras la aplicación de Parthenolide, no se obtiene la respuesta esperada, ya que los niveles de ambas son similares a los obtenidos tras la estimulación con IL-1β, y no menores como cabría esperar.
El análisis con PCR muestra una mayor expresión del mRNA-NF-κB en las células inhibidas con Parthenolide en relación a las células control, mientras que el análisis de la expresión del miR-34a muestra un aumento de ésta cuando las células están inducidas por IL-1β y una disminución cuando están inhibidas con Parthenolide.
La estimulación del condrocito con IL-1β origina un importante aumento de MCP-1, mientras que la inhibición origina un marcado descenso del mismo.
Discusión y conclusiones: La osteoartritis de rodilla es una enfermedad articular degenerativa con importante componente inflamatorio que afecta a pacientes de edad avanzada, sobretodo mujeres, con una importante disociación clínico-radiológica.
La determinación y cuantificación de las proteínas de NF-κB apoya la idea de que el Parthenolide actúa inhibiendo la vía de fosforilación de NF-κB, condicionando el acúmulo de éste a nivel citoplásmico, pero también su inactivación, lo que corrobora la expresión de MCP-1 en los diferentes cultivos.
Los resultados obtenidos hacen suponer que miR-34a actúa como un modulador positivo de la expresión del gen NF-κB, expresándose para activar NF-κB tras el estímulo por IL-1β y silenciándose con el aumento citoplásmico de NF-κB-p65, si bien no se ha observado una relación directa entre ambos.
De esta forma NF-κB y miR-34a se convierten en una futura diana terapéutica a seguir analizando, si bien son necesarios más estudios en relación a su mecanismo de acción, para poder utilizarlos con fines terapéuticos.Introduction: Osteoarthritis is a degenerative joint disease that is not only quite common, but also a clear example of a disease with a complex etiology, with its cause stemming from the interaction of acquired factors and genetic inheritance. NF-κB is a protein complex that controls DNA transcription and is part of the cellular response to several stimuli such as stress, cytokines, or viral or bacterial antigens. A microRNA is a small non-coding RNA which regulates gene expression by inhibiting messenger RNA. Over the last decade, the epigenetic mechanisms that occur during the degenerative process of osteoarthritis and the inflammatory phenomena have become key targets of study.
Methods and material: A clinical study was conducted on 27 patients who underwent a total knee arthroplasty for symptomatic osteoarthritis. subsequently, a histological and immunohistochemical study was performed on the proximal tibia cartilage samples obtained from these patients during the procedure, and an experimental model for chondrocyte cultivation was developed.
Three independent cultures were set up, one control, one stimulated with IL-1β and a third with IL-1β in absence and the presence of a NF-κB inhibitor called Parthenolide.
Western-Blot was used to analyse the expression of NF-κB; qPCR-RT was used for mRNA34a and mRNA from NF-κB, and finally, ELISA was used for the expression of MCP-1.
Results: The average age of the patients who underwent surgery was 70.03, with 66.7% of the cases being women. 51.9% of the patients presented disabling pain associated with repeated knee effusions with major functional incapacity. The Knee-society-score analysis showed average scores of 19.85, while 70.4% of the patients were grade III on the Albhäck scale. In 70.04% of the patients, there was no clinical and radiological correlation.
Histologically, it manifests as the loss of cartilage flexibility provokes a tear of the collagen fibers and the appearance of cleavages, that later evolve into fractures and finally ulcerations.
The immunohistochemical study highlights a strong NF-κB expression at the cytoplasm level of the chondrocytes.
In the chondrocytes cultures, the IL-1β considerably increased the NF-κB expression, however, the increase of phosphorylated form, NF-κB-p-p65 is very discreet, and as such, it is not activated in those cells.
Similarly, the addition of Parthenolide did not obtain the expected results, as the levels of both are similar to those obtained after the stimulation with IL-1β, and not less, as would be expected.
The PCR analysis shows a greater expression of mRNA-NF-κB in the cells inhibited with Parthenolide compared to the control cells, while the analysis of the miR-34a expression shows an increase when the cells are induced by IL-1β, and a decrease when they are inhibited with Parthenolide.
The stimulation of chondrocyte with IL-1β caused a notable increase of MCP-1, while the inhibition caused a marked decrease.
Discussion and conclusions: Osteoarthritis of the knee is a degenerative joint disease with a significant inflammatory aspect that affects patients in their later years, most often women, with a significant clinical-radiological disassociation.
Identifying and quantifying the NF-κB proteins supports the idea that Parthenolide acts to inhibit the path of NF-κB phosphorylation, leading to the accumulation of it to cytoplasmic level, but also its deactivation, which is corroborated by the MCP-1 expression in the different cultures.
The results obtained suggest that miR-34a acts as a positive modulator for the expression of the NF-κB gene, expressing itself to activate NF-κB after being stimulated by IL-1β and silenced by the cytoplasmic increase of NF-κB-p65, even if no direct relation between them has been observed.
Hence, NF-κB and miR-34a have become a future therapeutic target for continued analysis, as more studies are necessary regarding its functional mechanisms, in order to use them for therapeutic means
