In vitro evaluation of toxic effects, bioavailability and bioaccesibility of beauvericin, enniatins and fusaproliferin = Evaluación in vitro de los efectos tóxicos, biodisponibilidad y bioacesibilidad de beuavericina, eniantinas y fusaproliferina

Abstract

Los hongos de Fusarium pueden producir micotoxinas hexadepsipeptidicas, como beauvericina (BEA) y eniatinas (ENs) e isoprenoides como la fusaproliferina (FUS), las cuales se encuentran de forma natural en los alimentos y piensos. En las últimas décadas se han publicado datos, aunque escasos, sobre su toxicidad potencial en humanos y animales. Los objectivos de esta tesis fueron evaluar: los efectos citotóxicos de las FUS, BEA y ENs A, A1, B y B1 en células Caco-2, CHO-K1 y HT-29; los efectos citotóxicos de las ENs combinadas, la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la producción de peroxidación lipídica (LPO) tras exposición a FUS, BEA y ENs en las células Caco-2; la citoprotección del glutatión (GSH) y de polifenoles frente a la citotoxicidad de las ENs y BEA en las células Caco-2 y CHO-K1. Además, se determinó el efecto de la BEA y ENs sobre el ciclo celular, apoptosis/necrosis, la alteración de la membrana mitocondrial y efectos genotoxicos tras su exposición en células Caco-2; la biodisponibilidad de BEA y FUS mediante las células Caco-2 y la bioaccesibilidad de ENs A, A1, B y B1 a partir de cereales contaminados artificialmente. Los resultados demostraron que BEA y las ENs A, A1, B y B1 son citotóxicas dependiendo de la dosis y tiempo en las células Caco-2, HT-29 y CHO-K1. Las células CHO-K1 y Caco-2 fueron más sensibles a las ENs del grupo B y del grupo A, respectivamente. FUS no mostró efectos citotóxicos en el rango de concentraciones ensayadas. Se observó efecto sinérgico con las combinaciones de las ENs A1+B, A1+B1 y A+A1+B1 en las células Caco-2; mientras que la combinación de ENs B+B1 a bajas concentraciones mostraron efecto sinérgico. Se produjo estrés oxidativo en las células Caco-2 tras exponerlas a BEA y ENs en el siguiente orden: EN A1=EN A>EN B1>BEA>EN B. Como consecuencia del daño oxidativo se produjo LPO en el orden: BEA>EN A>EN A1=EN B1>EN B. FUS no produjo daño oxidativo. BEA redujo los niveles de GSH y aumentó los de glutatión oxidado (GSSG) en células Caco-2; mientras que los polifenoles mostraron efecto citoprotector en las células CHO-K1 (t-pterostilbeno>miricetina>rutina>quercetina 3-β-glucosido>quercetina) frente a la citotoxicidad inducida por las ENs. La BEA y ENs detuvieron el ciclo celular en la fase G2/M, lo cual se relaciona con el desequilibrio oxidativo inducido por la BEA y el daño al ADN inducido por las ENs A y A1 en las células Caco-2. Además, se observó muerte celular por apoptosis y necrosis, caracterizadas por alteración del potencial de membrana mitocondrial. Por otra parte, se observaron elevados porcentajes en la biodisponibilidad de BEA y FUS en las células Caco-2, siendo la FUS la más biodisponibles. La bioaccesibilidad de las ENs, mediante el modelo simulado de digestión in vitro, disminuyó siguiendo el orden: EN A=EN B1>EN B>EN A1. Los datos in vitro obtenidos en esta tesis pueden incorporarse a los datos de toxicidad de BEA, EN y FUS disponibles en la literatura y contribuir, junto a los datos in vivo, a su evaluación del riesgo.Fusarium spp. can produce hexadepsipeptidic mycotoxins, such as beauvericin (BEA) and enniatins (ENs) and the isoprenoidic fusaproliferin (FUS), which occurr naturally in food and feed. In the last decades they showed a potential toxicity to human and animal health, so far there are few data on their toxicity. The objectives of the study were to evaluate the cytotoxic effects of FUS, BEA and ENs A, A1 , B and B1 in Caco-2, CHO-K1 and HT-29 cells, the cytotoxic effects of ENs in combination, the generation of reactive oxygen species (ROS); the production of lipid peroxidation (LPO) after exposure to FUS, BEA and ENs in Caco-2 cells; the cytoprotection of glutathione (GSH) and some polyphenols against the cytotoxicity of ENs and BEA in the Caco-2 and CHO-K1 cells; the effect on the cell cycle, apoptosis/necrosis and mitochondrial membrane potential; the genotoxic effects after exposure to BEA and ENs in Caco-2 cells; BEA and FUS bioavailability by using Caco-2 cells and the bioavailability of ENs A, A1, B and B1 from artificially contaminated grain. BEA and ENs A, A1, B and B1 are cytotoxic in a dose and time-dependent manner in Caco-2, HT-29 and CHO-K1 cells. CHO-K1 and Caco-2 cells were more sensitive to the ENs in group B and group A, respectively. FUS had no cytotoxic effect in the concentrations tested. Synergistic effect was obtained after exposure to the combinations of ENs A1+B, A1+B1, A+A1+B1. Antagonism was produced by the combination of ENs B+B1 at low concentrations, in Caco-2 cells. Oxidative stress was observed after exposure to BEA and ENs in Caco-2 cells in the order: EN A1=EN A>EN B1>BEA>EN B. As a result of oxidative damage LPO occurred in the order: BEA>EN A>EN A1=EN B1>EN B. FUS did not produce any oxidative damage. BEA reduced GSH levels and increased oxidized glutathione (GSSG) levels in Caco-2 cells and polyphenols showed cytoprotective effect in CHO -K1 (t-pterostilbene > myricetin > rutin > quercetin 3-β-glucoside > quercetin) against ENs induced cytotoxicity. BEA and ENs arrested the cell cycle at G2/M phase, which is related to the oxidative imbalance induced by BEA and DNA damage induced by ENs A and A1 in Caco-2 cells. Apoptosis and necrosis were induced and characterized by the mitochondrial membrane potential alteration. High percentages of BEA and FUS bioavailability were determined through Caco-2 cells. FUS was more bioavailable than BEA. ENs bioaccessibility was reduced after applying the in vitro digestion method, in the order: EN A=EN B1>EN B>EN A1. In vitro data obtained in this research work can be incorporated into the whole data related to the cytotoxicity of BEA, EN and FUS in literature and, together with in vivo studies, could contribute to a future risk assessment of them