RESUMEN
Con la finalidad de diseñar nuevas estrategias biotecnológicas relacionadas con la contaminación por cobre (Cu), los esfuerzos de esta Tesis se centraron en tres objetivos:
1. Identificación de la respuesta molecular a diferentes niveles de Cu en el medio en Arabidopsis thaliana mediante análisis global de los cambios de expresión génica entre exceso y déficit de Cu.
Determinamos que el medio estándar de crecimiento en placa ½ MS es deficitario en Cu para las plántulas (~ 4 g/g P.S.), mientras que el mismo medio suplementado con Cu 10 M provoca una elevada concentración endógena del metal próxima al exceso (~ 30 g/g P.S.).
Las respuestas moleculares observadas mediante micromatrices a estos niveles de Cu en el medio se dividen en tres categorías:
- Respuesta al estrés y alteración del metabolismo, incluyendo la respuesta al estrés hídrico y salino, la división celular y la modificación de DNA en exceso de Cu, así como la respuesta al estrés por patógenos, expansión celular y metabolismo del azufre en déficit del metal. El ritmo circadiano también se encuentra alterado por los niveles de Cu. En estas respuestas están implicados factores de regulación por déficit de Cu como las SPLs y los miRNAs.
- Prioridad en el uso del Cu para proteínas esenciales, como la plastocianina, y sustitución de proteínas con función equivalente que utilizan otros metales en sus centros activos, como la Cu/ZnSOD y la FeSOD cloroplásticas. En este sentido, CSD2 y FSD1 son buenos indicadores de niveles elevados y deficitarios de Cu, respectivamente, dentro de la célula.
- Regulación de los niveles intracelulares de Cu mediante alteración de los mecanismos de incorporación del metal en la célula, como los transportadores de Cu de alta afinidad COPT, y de destoxificación del metal, como la familia de ATPasas tipo P transportadoras de Cu.
2. Caracterización de transportadores de Cu de familias génicas que responden a los diferentes niveles de Cu en Arabidopsis thaliana.
- HMA5, ATPasa tipo P transportadora de Cu.
HMA5 se expresa principalmente en raíces y su expresión se induce en plántula entera específicamente por Cu. Mutantes por pérdida de función hma5 son hipersensibles específicamente al Cu y acumulan más Cu en las raíces que las plantas silvestres en exceso de Cu.
- COPT3, transportador de Cu de alta afinidad.
COPT3 se expresa principalmente en flores y semillas. COPT3 se localiza intracelularmente, probablemente en algún compartimento de la ruta de secreción. La sobrexpresión de COPT3 en plantas transgénicas provoca retraso en el desarrollo de la planta, cotiledones en forma caída y estambres más cortos que los de plantas silvestres. Estas plantas sobrexpresoras muestran hipersensibilidad al Cu, acumulan más Cu en las semillas y, en exceso de Cu, acumulan más Cu que las plantas silvestres en plántula entera.
3. Obtención de plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana con posibles aplicaciones biotecnológicas en procesos de fitorremediación, mediante el estudio del transportador de Cu de alta afinidad COPT1.
La expresión de COPT1 en plántula entera se reprime específicamente por Cu. COPT1 se localiza en la membrana plasmática. La sobrexpresión de COPT1 en plantas transgénicas provoca reducción del tamaño global de la planta, cotiledones en forma de remo, curvatura cóncava de las hojas, pétalos y estambres protegidos por los sépalos y escasa fertilidad. Estas plantas sobrexpresoras son hipersensibles específicamente al Cu y acumulan más Cu respecto a las plantas silvestres. La sobrexpresión simultánea de COPT1 y TcMT3 podría ser una estrategia candidata en procesos de fitorremediación de suelos contaminados por Cu. Estas plantas reúnen dos características fundamentales para este tipo de aplicaciones biotecnológicas: acumulación y tolerancia al Cu.
__________________________________________________________________________________________________With the aim of designing new biotechnological strategies related to copper (Cu), the objectives of this Thesis were:
1. Identification of the Arabidopsis molecular responses to Cu status in the medium by microarray global analysis of gene expression.
The internal Cu content in seedlings grown in the ½ MS medium is below the sufficiency levels, whereas the same medium supplemented with Cu 10 M provoke a high endogenous metal concentration close to excess.
The responses observed are divided in three categories:
- Metabolic changes and stress responses. Circadian rythm is also alterated. Transcription factors and miRNAs are implicated.
- Prioritizing the use of Cu for essential proteins and substitution of counterpart proteins with different metals at their active sites. CSD2 and FSD1 expression is a good marker of Cu levels in Arabidopsis.
- Regulation of intracellular Cu levels by modification of expression of metal homeostasis components, such as the COPT and HMA families of transporters.
2. Characterization of Cu transporters from gene families that respond to Cu in Arabidopsis.
- HMA5, Cu transporting P-type ATPase.
HMA5 is mainly expressed in roots and specifically induced by Cu. The hma5 knockout mutants are specifically Cu hypersensitive and accumulate Cu in roots under Cu excess.
- COPT3, high affinity Cu transporter.
COPT3 is mainly expressed in flowers and seeds. COPT3 is intracellulary located, probably at some secretory pathway compartment. COPT3 overexpression provokes a delay in plant development, phenotypically characteristic cotyledons and short stamens. These overexpressing plants are Cu hypersensitive, accumulate Cu in seeds and, under Cu excess, accumulate Cu in the whole seedling.
3. Obtaining Arabidopsis transgenic plants with possible biotechnological applications, by overexpressing the high affinity Cu transporter COPT1.
COPT1 expression is specifically repressed by Cu. COPT1 is located at the plasma membrane. COPT1 overexpression provokes biomass reduction, phenotypically characteristic cotyledons, concave leaves, petals and stamens protected by sepals and low fertility. These overexpressing plants are specifically Cu hypersensitive and accumulate Cu. Simultaneous overexpression of COPT1 and TcMT3 could be a candidate strategy for phytoremediation of Cu contaminated soils. These plants possess two fundamental characteristics for this biotechological application: Cu accumulation and tolerance
