Um grande nmero de fungos so conhecidos como produtores de metablitos secundrios, ativos sobre diversosorganismos vivos, provocando inibio de crescimento, doenas e posteriormente sua morte. Diversos estudos mostraramque o fungo Nomuraea rileyi,  um produtor de metablitos ativos sobre insetos e microrganismos mostrando atividadeinseticida sobre larvas de Bombyx mori. O propsito deste trabalho foi analisar a atividade mutagnica de um metablitoproduzido pelo fungo Nomuraea rileyi, sobre as linhagens TA98 e TA100 de Salmonella thiphymurium. A anlise estatsticados resultados obtidos indicou claramente a ausncia de mutagenicidade para o metablito produzido pelo fungo Nomuraearileyi. O metablito, no induz a mutaes de substituies de pares de base e frameshift como demonstrado pelos testes degenotoxicidade

Azevedo, João Lúcio

Barros, Neiva Monteiro de

Onofre, Sideney Becker

Portuguese

Um grande n&uacute;mero de fungos s&atilde;o conhecidos como produtores de metab&oacute;litos secund&aacute;rios, ativos sobre diversosorganismos vivos, provocando inibi&ccedil;&atilde;o de crescimento, doen&ccedil;as e posteriormente sua morte. Diversos estudos mostraramque o fungo Nomuraea rileyi, &eacute; um produtor de metab&oacute;litos ativos sobre insetos e microrganismos mostrando atividadeinseticida sobre larvas de Bombyx mori. O prop&oacute;sito deste trabalho foi analisar a atividade mutag&ecirc;nica de um metab&oacute;litoproduzido pelo fungo Nomuraea rileyi, sobre as linhagens TA98 e TA100 de Salmonella thiphymurium. A an&aacute;lise estat&iacute;sticados resultados obtidos indicou claramente a aus&ecirc;ncia de mutagenicidade para o metab&oacute;lito produzido pelo fungo Nomuraearileyi. O metab&oacute;lito, n&atilde;o induz a muta&ccedil;&otilde;es de substitui&ccedil;&otilde;es de pares de base e frameshift como demonstrado pelos testes degenotoxicidade

Universidade Paranaense: Revistas Científicas da UNIPAR

Arq. Ciênc. Saúde Unipar, Umuarama, v.8(1), jan./abr., 200471Biólogo, Doutor em Processos Biotecnológicos, Prof. Titular da disciplina de Microbiologia da Universidade Paranaense, UNIPAR, Campus de Francisco Beltrão – PR . e-mail: sideney@unipar.br2Bióloga, Doutora em Genética e Biologia Molecular, Instituto de Biotecnologia da Universidade de Caxias do Sul - Caxias do Sul - RS. 3Departamento de Genética de Microrganismos, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz - Universidade de São Paulo - Piracicaba - SP. E-mail: jazevedo@carpa.ciagri.usp.br.Endereço para correspondência: Av. Júlio Assis Cavalheiro, 2000. Curso de Ciências Biológicas, Universidade Paranaense, Campus de Francisco Beltrão, PR.Introdução Um grande número de fungos são conhecidos como produtores de metabólitos secundários, ativos sobre diversos organismos vivos, provocando inibição de crescimento, doenças e posteriormente sua morte. Dentre esses metabólitos, destacamos as afl atoxinas, produzidas por linhagens de Aspergillus. fl avus (DIENER & DAVIS, 1969), ochratoxina de Aspergillus ochraceus (KODAIRA, 1961; MYOKEY et al.,1969); o gênero Penicillium, produzindo vários metabólitos tais como toxinas e antibióticos. Vários fungos entomopatogênicos também são produtores de metabólitos com ação sobre microrganismos e insetos, dentre eles o fungo, Metarhizium anisopliae, produzindo um ciclodipepsipeptídeo denominado destruxina, ativo sobre insetos e inibindo o crescimento de diversas linhagens de bactérias, (KODAIRA, 1969; CRISAN, 1971; KAIJIANG ATIVIDADE MUTAGÊNICA DE UM OLIGOPEPTÍDEO PRODUZIDO PELO FUNGO NOMURAEA RILEYI (FARLOW) SAMSONSideney Becker Onofre1Neiva Monteiro de Barros2João Lúcio Azevedo3ONOFRE, S.B.; BARROS, N.M.; AZEVEDO, J.L. Atividade mutagênica de um oligopeptídeo produzido pelo fungo Nomuraea Rileyi (Farlow) Samson. Arq. Ciênc. Saúde Unipar, Umuarama, 8(1), jan./abr. p.7-10, 2004.RESUMO: Um grande número de fungos são conhecidos como produtores de metabólitos secundários, ativos sobre diversos organismos vivos, provocando inibição de crescimento, doenças e posteriormente sua morte. Diversos estudos mostraram que o fungo Nomuraea rileyi, é um produtor de metabólitos ativos sobre insetos e microrganismos mostrando atividade inseticida sobre larvas de Bombyx mori. O propósito deste trabalho foi analisar a atividade mutagênica de um metabólito produzido pelo fungo Nomuraea rileyi, sobre as linhagens TA98 e TA100 de Salmonella thiphymurium. A análise estatística dos resultados obtidos indicou claramente a ausência de mutagenicidade para o metabólito produzido pelo fungo Nomuraea rileyi. O metabólito, não induz a mutações de substituições de pares de base e frameshift como demonstrado pelos testes de genotoxicidade.PALAVRAS-CHAVE: fungos, mutagênico, carcinogênico, metabólitosMUTAGENIC ACTIVITY OF AN OLIGOPEPTIDE PRODUCED BY THE FUNGUS Nomuraea rileyi (FARLOW) SAMSONONOFRE, S.B.; BARROS, N.M.; AZEVEDO, J.L. Mutagenic activity of an oligopeptide produced by the fungus Nomuraea Rileyi (Farlow) Samson. Arq. Ciênc. Saúde Unipar, Umuarama, 8(1), jan./abr. p.7-10, 2004.ABSTRACT: A great number of fungi are known as producers of secondary metabolites active on several living organisms, causing growth inhibition, illnesses and eventually death. Many studies had shown that the fungus Nomuraea rileyi is a producer of active metabolites acting upon insects and microorganisms and showing insecticidal activity on larvae of Bombyx mori. The purpose of this work, was to analyze the mutagenic activity of a metabolite produced by the fungus N. rileyi, on the lineages TA98 and TA100 of Salmonella thiphymurium. The statistical analysis of the results clearly indicated the absence of mutagenicity for the metabolite produced by N. rileyi. The metabolite do not induce to base-pair replacement mutations and frameshift as demonstrated by the genotoxic tests.KEY-WORDS: Nomuraea rileyi, mutagenic, carcinogenic, metabolites, NRtox& ROBERTS, 1986; DUMAS, et al., 1995; CIANCIO, 1996). Os fungos Beauveria bassiana, Peacilomyces fumoso-roseus, Fusarium moniliforme, também produzem ciclodipepsipeptídeos beauvericina e o complexo enniatina (WEST & BUGGS, 1968; BERNARDINI et al., 1975; GROVE & POPLE, 1980; RICHARD et al., 1995; JEGOROV et al., 1995; LOGRIECO et al., 1996). Diversos estudos mostraram que o fungo Nomuraea rileyi, é um produtor de metabólitos ativos sobre insetos e microrganismos (MYKUMI & KAWAKAMI, 1975; IGNOFFO et al., 1976; WASTI & HARTMANN, 1978; MOHAMED & NELSON, 1984; ONOFRE et al., 1999), em trabalhos anteriores realizados por YE et al., (1993), mostraram atividade inseticida sobre larvas de Bombyx mori. Nesse contexto o propósito deste trabalho, foi analisar a atividade mutagênica de um metabólito produzido pelo fungo Nomuraea rileyi, sobre as linhagens TA98 e TA100 de Salmonella thiphymurium.Arq. Ciênc. Saúde Unipar, Umuarama, v.8(1), jan./abr., 2004 ONOFRE et al.8Material e métodosMeio de crescimento SSY - Sabouraud sacarose acrescido de extrato de levedura, contendo: peptona (1%); sacarose (4%) extrato de levedura (0,5%). O pH foi ajustado para 6,0. O meio foi preparado em recipientes de 12 litros e autoclavado a 120ºC em 1 atm. de pressão, por uma hora, ONOFRE et al. 2002.Produção e isolamento do metabólito Um quimiostato com capacidade de quatro litros e, meio foram inoculados com uma suspensão de esporos da linhagem SA-86101 do fungo Nomuraea rileyi, numa concentração de 5,4x109 conídios/mL. Este recipiente foi mantido em condições controladas de temperatura 26±1ºC e oxigenação constante por 12 dias. Após este período, o meio de cultura foi fi ltrado, descartando-se o micélio. Os metabólitos produzidos foram separados num extrator líquido/líquido, utilizando-se meio de cultivo - diclorometano na proporção 10:1 (v:v), os quais foram concentrados em evaporador rotativo, a uma temperatura de 35ºC, obtendo-se (135mg/L) de metabólito mais impurezas. O resíduo contendo metabólitos mais impurezas, foi passado através de uma coluna contendo sílica gel GF, na proporção de 100:1 (peso/peso). Benzeno e benzeno, contendo quantidades crescentes de acetato de etila (5, 10, 25, 50%), foram usados como eluentes no fl uxo de 1mL/minuto. Frações de cinco mililitros foram coletados. Cada fração foi examinada em cromatografi a de camada delgada (CCD). O sistema de solventes utilizados foi clorofórmio:metanol:acetato de etila, 18:1:1 (v:v:v), e aquelas frações que continham as mesmas características, foram agrupadas após evaporação a vácuo e analisadas em espectrofotômetro de infravermelho. Para remover outras substâncias, uma pequena quantidade de éter de petróleo foi adicionada aos cristais. O solvente foi descartado após permanecer no congelador por um período de 4 horas, a uma temperatura de -4ºC. Após a separação, o metabólito foi armazenado a uma temperatura de -20ºC, para posterior análise da atividade biológica, ONOFRE et al. 2002.Linhagem de Salmonella thyphimurium Para as avaliações foram utilizadas as linhagens TA100 e TA98, construídas originalmente por AMES et al., (1973). Essas linhagens são auxotrófi cas para histidina, e o teste permite a avaliação do potencial mutagênico do produto pela indução de mutação reversa das linhagens TA98 e TA100 de S. typhimurium, para o aminoácido histidina e presença de mistura de ativação metabólica.Fração microssomal S9 Foi preparada a partir de fígado de ratos, Sprague-Dawleys pré-tratados com Aroclor-1254 (mistura bifenil policrorinada - PCB), adquirida da Molecular Toxicology Inc. (MoltoxTM) Lote 0337.Meios para crescimento bacteriano e controles positivos O crescimento das células bacterianas foi feito em meio líquido completo NB, contendo 0,8% de meio nutriente para crescimento (Nutrient Broth, BBL, Maryland, EUA) e 0,5% de cloreto de sódio. Para o teste de toxidez em placa foi utilizado meio completo solidifi cado com 1,5% de ágar (meio NA). No teste mutagênico foi usado meio mínimo constituído por uma mistura de glicose a 40% e meio E de Vogel-Booner, o qual contém sulfato de magnésio a 1%, ácido cítrico monohidratado a 10%, fosfato de potássio dibásico a 50%, e fosfato de sódio e amônio a 17,5%, solidifi cado com ágar a 1,5%. Para o plaqueamento em meio mínimo foi empregado o ágar de superfície ou gelose, constituído por 0,6% de ágar e 0,5% de NaCl, ao qual se adicionou um solução de histidina 7,0 g/mL. Nos testes para confi rmação do genótipo da linhagem testadora, foram utilizadas placas de meio mínimo, contendo ampicilina 25 (g/mL) e histidina (0,1 mL de uma solução 0,1M). Nos testes sem ativação metabólica, foram utilizados a azida sódica (E Merck, Alemanha) e 4NQO (4 nitroquinoleína 1- óxido, Sigma Chemical Company, St. Louis, EUA) para as linhagens TA100 e TA98, respectivamente. Nos testes com ativação metabólica utilizou-se a Afl atoxina B1 (Sigma Chemical Company, St. Louis, EUA).Teste de genotoxidade A metodologia foi desenvolvida pelo procedimento de incorporação em placa, segundo MARON & AMES (1983). No teste para determinar a atividade mutagênica, amostras em diferentes concentrações do oligopeptídeo NRtox (ONOFRE et al. 2002) (10, 25, 100, 500, 1000 µL), foram adicionadas a 100 µL de uma cultura das linhagens testadoras (crescimento de 1,2 x 109 células/mL em meio NB), em presença ou ausência de S9 mix (20 µL da fração S9 contendo 16,3 mg/mL de proteína por 500 µL de S9 mix), incubadas ao abrigo da luz e à temperatura de 37º C. Após esta etapa, adicionou-se ao tubo teste 2 mL do ágar superfície, previamente incubado a 45º C e suplementado com solução de histidina e biotina. Após agitação breve, procedeu-se à semeadura em placas contendo meio E-gelosado. A contagem das colônias revertentes foi realizada após 48 horas de incubação em estufa a 37º C (incubadora BOD - Ética). Em cada teste foram acrescentados os controles, negativos - solução de Tween-80 0,1% e positivos - 5,0 µL/placa de azida sódica (AZS); 0,5 µg/placa de 4-óxido-1-nitroquinoleína (4NQO), em ensaios sem fração S9 para TA 100 e TA 98, respectivamente. Em teste com fração metabolizante, foram adicionados 10 g/placa de afl atoxina B1 (AFB1, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EUA) para TA 100 e TA 98.Resultados e discussãoProdução e isolamento do metabólito Utilizando-se a metodologia descrita, obteve-se 7,4 µg/mL de NRtox. As análises de espectrofotometria em infravermelho e ultravioleta indicam a presença de um oligopeptídeo, Figura 1 e 2, (ONOFRE et al. 1999, ONOFRE et al. 2002). Teste de genotoxidade Os resultados obtidos referente a atividade mutagênica do metabólito, em ausência e presença de ativação metabólica, estão sumarizados na tabela 1.Arq. Ciênc. Saúde Unipar, Umuarama, v.8(1), jan./abr., 2004Atividade mutagênica de um Oligopeptídeo...9 Podem ser verifi cados nesta tabela que o número de revertentes his+ induzidos pelo metabólito não aumentou signifi cativamente em relação à concentração zero do metabólito, tanto nos testes realizados em presença, como em ausência de ativação metabólica. Portanto, para todas as doses utilizadas, a freqüência de revertentes permaneceu praticamente igual à espontânea. A análise estatística dos resultados obtidos indicou claramente a ausência de mutagenicidade para o metabólito (NRtox) produzido pelo fungo Nomuraea rileyi. O metabólito não induz a mutações de substituições de pares de base e frameshift como demonstrado pelos testes de genotoxicidade. Verifi cou-se nessas tabelas que o número de revertentes his+ induzidos pelo peptídeo, produzido pelo fungo Nomuraea rileyi (NRtox), não aumentaram signifi cativamente em relação a concentração zero, tanto nos testes realizados em presença, como em ausência de ativação metabólica. Portanto, para todas as concentrações utilizadas, a freqüência de revertentes permaneceu praticamente igual à espontânea. A análise estatística dos resultados obtidos, indicou claramente, a ausência de mutagenicidade para o peptídeo Nrtox, produzido pelo fungo Nomuaraea rileyi.Figura 1 - Espectrometria de infravermelho referente ao metabólito produzido pelo fungo Nomuraea rileyi.Figura 2 - Espectrometria de ultravioleta referente ao metabólito produzido pelo fungo Nomuraea rileyi.TABELA 1 – Resposta das linhagens TA98 e TA100 de Salmonella typhimurium, ao tratamento com diferentes concentrações de Nrtox, no teste de Salmonella/microssoma, sem ativação metabólica.Dose TA98 TA100Concentração µL/mL R/placaa IMb R/Placa IM0,00 19,67±4,04 1,00 95,67±4,04 1,0010 16,67±2,08 0,84 97,00±12,17 1,0125 17,00±6,93 0,86 83,00±6,00 0,86100 21,00±6,56 1,06 85,67±8,08 0,89500 22,00±3,21 1,13 101,33±17,21 1,051000 21,33±8,08 1,08 102,33±29,69 1,06Análise estatística:P anal. Variância  72,4%Mod. Aceitável (p)  linear 80,1%P dose resposta  14,6%Resultado  NegativoP anal. Variância  72,4%Mod. Aceitável (p)  linear 80,1%P dose resposta  14,6%Resultado  NegativoaNúmero de revertentes his+/placa; média de, no mínimo 3 placas + desvio padrão.bÍndice de mutagênese: R/placa induzidos na amostra/revertentes na concentração zero.Controles positivos: TA98, 4NQO 0,5µg/placa, 155,33 revertentes; TA100, azida sódica 10µg/placa, 469 revertentes.TABELA 2 – Resposta das linhagens TA98 e TA100 de Salmonella typhimurium, ao tratamento com diferentes concentrações de NRtox no teste de Salmonella/microssoma, com ativação metabólica.Dose TA98 TA100Concentração µL/mL R/placaa IMb R/Placa IM0,00 22,67±3,51 1,00 131,33±8,58 1,0010 26,33±3,06 1,16 128,00±22,72 0,9725 20,67±4,93 0,91 141,00±11,27 1,07100 23,33±2,08 1,03 125,67±15,63 0,96500 22,67±4,93 1,00 155,67±28,57 1,181000 26,00±6,56 1,14 113,00±15,39 0,86Análise estatística:P anal. Variância  62,5%Mod. Aceitável (p)  linear 52,1%P dose resposta  34,5%Resultado  NegativoP anal. Variância  16,9%Mod. Aceitável (p)  linear 12,5%P dose resposta  75,1%Resultado  NegativoControles positivos: Afl atoxina B1, 10µg/placa, 441 revertentes.Arq. Ciênc. Saúde Unipar, Umuarama, v.8(1), jan./abr., 2004 ONOFRE et al.10ReferênciasAMES, B. N.; LEE, F. D.; DURSTON, W. E. An improved bacterial test system for the detection and classifi cation of muagens and carcinogens. Proc. Natl. Acad. Sci. v. 70, p. 782-786, 1973.BERNARDINI, M. A.; CARILLI, G.; PACIONI, B. SANTURBANO. Isolation of beauvericin from paecilomyces fumosoroseus. Phytochemistry. v. 14, p. 1865, 1975.CIANCIO, A. Observations on the nematicidal properties of some mycotoxins. Fundamental and Applied Nematology, v. 18, p. 451-454, 1996.CRISAN, E. V. Mechanism responsible for release of toxin by Metarrhizium anisopliae spores in mosquito larvae. Journal of Invertebrate Pathology, v.17, p. 260-264, 1971.DIENER, L. U.; DAVIS, N. D. Afl atoxin formation by Aspergillus fl avus. In:  L. A. GOLDBLATT. Afl atoxin.  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Atividade mutagênica de um oligopeptídeo produzido pelo fungo nomuraea rileyi (farlow) samson

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