Programa de Doctorado en Biotecnología y Tecnología Química1) INTRODUCCIÓN El boro (B) es un nutriente esencial para las plantas vasculares y tanto su deficiencia como su toxicidad afectan a numerosos procesos metabólicos y fisiológicos (Nable y col., 1997; Blevins y Lukaszewski, 1998; Bolaños y col., 2004; Reid, 2007; Camacho-Cristóbal y col., 2008; Herrera-Rodríguez y col., 2010; Martín-Rejano y col., 2011). El B, en forma de ácido bórico o borato, es capaz de formar complejos con una gran variedad de compuestos biológicos que contienen dos grupos hidroxilo en configuración cis. Una de las principales funciones del B en las plantas vasculares está relacionada con la pared celular, ya que se establecen enlaces éster entre el anión borato y los residuos de apiosa del ramnogalacturonano II (RGII); la construcción de este complejo es fundamental para la estructura y función de la pared celular (O¿Neill y col., 2004), y desempeña una función crítica en los tejidos en crecimiento. Entre el 80 y el 90% del B total presente en la planta se encuentra en las paredes celulares formando dímeros de RGII, siendo este complejo esencial para la estructura y función de la pared celular; por lo tanto, se puede decir que la principal función de este micronutriente es estructural (Blevins y Lukaszewski, 1998). La deficiencia en B no sólo tiene efectos sobre la estructura y función de la pared celular de las plantas vasculares sino que, además, influye sobre otros muchos procesos: metabolismo del ácido indolacético, translocación de azúcares, metabolismo de carbohidratos, síntesis de ácidos nucleicos, crecimiento del tubo polínico, potencial de membrana, enzimas del plasmalema, flujo de iones a través de las membranas, proteínas del citoesqueleto (Blevins y Lukaszewski, 1998; Bolaños y col., 2004; Goldbach y Wimmer, 2007), acumulación de compuestos fenólicos y poliaminas (Camacho-Cristóbal y col., 2002, 2004 y 2005), asimilación de nitrógeno (Camacho-Cristóbal y González-Fontes, 2007; Beato y col., 2010, 2011 y 2014), y desarrollo de la raíz (Martín-Rejano y col., 2011), entre otros. Aunque se desconoce el mecanismo molecular por el cual la planta es capaz de sentir la deficiencia de este micronutriente y desarrollar la respuesta fisiológica, recientemente se ha propuesto que el calcio podría estar directamente implicado en la transmisión de esta señal. Se conocen múltiples estreses bióticos y abióticos que afectan a la concentración de calcio citosólico, provocando ¿firmas de calcio¿ (Sanders y col., 2002; Hetherington y Brownlee, 2004), es decir, patrones espacio-temporales de cambio en los niveles de calcio que son específicos para cada estímulo. Estas ¿firmas de calcio¿ se deben a movimientos de calcio regulados mediante canales y bombas (Sanders y col., 2002; Hetherington y Brownlee, 2004; Bastistic y Kudla, 2012); posteriormente son percibidas, descodificadas y transmitidas mediante proteínas de unión a calcio, como: calmodulinas, proteínas similares a calmodulinas, quinasas dependientes de calcio y proteínas similares a calcineurina-B (Sanders y col., 2002; Hashimoto y Kudla, 2011). Cuando estas proteínas se unen al calcio, se activan interaccionando a su vez con otras proteínas; de esta manera, la información contenida en la ¿firma de calcio¿ es transmitida a través de eventos de fosforilación, cambios en las interacciones entre proteínas o mediante regulación transcripcional y, por lo tanto, induciendo las respuestas ante cada estrés. Se piensa que algunos de estos sensores de calcio podrían estar involucrados en la señal de deficiencia de B. 2) OBJETIVOS A pesar de que la deficiencia de B provoca múltiples efectos en la fisiología y bioquímica de las plantas vasculares, se desconoce el mecanismo a través del cual las plantas son capaces de sentir y transmitir esta señal. Recientemente se ha propuesto que el calcio (Ca2+) podría mediar en este proceso de señalización. Por tanto, los objetivos de esta investigación fueron determinar si hay una relación entre la deficiencia de B y la concentración de calcio citosólico ([Ca2+]cit), y si el Ca2+ participa en la transmisión de la señal de deficiencia de B en las raíces de Arabidopsis thaliana; también fue interesante determinar qué genes/proteínas participarían en esta señalización, así como estudiar la interacción con otros cationes, como el potasio. 3) METODOLOGÍA En un primer momento se estudió si la deficiencia de B a corto plazo afectaba a los niveles de expresión de genes relacionados con la señalización de calcio en las raíces de Arabidopsis. Con este fin, se cultivaron plántulas de la estirpe silvestre Col0 y se transfirieron a medios con suficiencia o deficiencia de B durante 6 y 24 horas, se tomaron muestras de raíces de las cuales se hizo una extracción de RNA y una posterior síntesis de cDNA para analizar los niveles de expresión mediante Q-RT-PCR. También se estudió el efecto de la adición al medio de reactivos que alteraran la disponibilidad de calcio para las plántulas, con el objetivo de determinar si había cambios en el patrón de expresión de los genes analizados. Posteriormente se analizó la actividad GUS bajo el control de varios promotores (pCML12::GUS, pCML24::GUS, pCPK28::GUS, pACA10::GUS y pMYB15::GUS) en raíces de plántulas de Arabidopsis que habían sido sometidas a deficiencia de B durante 6 y 24 horas, con el objetivo de confirmar los resultados obtenidos previamente. Al igual que antes, se repitieron los experimentos añadiendo diferentes reactivos a los medios de cultivo. A continuación, se estudió si el efecto de la deficiencia de B a corto plazo afectaba únicamente a la expresión génica o si también lo hacía sobre los niveles de proteínas en las raíces de Arabidopsis. Para ello se realizaron diferentes WESTERN-BLOTS para las proteínas: CAX3, CNGC19 y ACA10, usando para ello anticuerpos específicos contra cada una de ellas. El siguiente paso fue determinar si la deficiencia de B a corto plazo afectaba realmente a los niveles de calcio en plántulas de Arabidopsis.Universidad Pablo de Olavide. Departamento de Fisiología, Anatomía y Biología Celula
