Epoxide hydrolases (EH) catalyze hydrolysis of epoxides to the corresponding vicinal diols. By site-directed mutagenesis, a total of 22 mutants were constructed, followed by analyzing their kinetics. Through these experiments, mutation of G32, S39, and D58, located at a highly conserved region of EHs known to date, led to a 2-fold higher specific activity than that of wild-type.エポキシド水解酵素は, エポキシドを加水分解し, ジオールに変換する触媒作用を示す. ダイズエポキシド水解酵素の22種の部位特異的変異体の作出を試み,  6種の可溶性変異酵素が得られた. 得られた変異酵素の内, ゲノム上極めて高度に保存されている領域に変異を有する 3種の酵素については, 野生型酵素の 2倍近い酵素活性が得られた. 野生型酵素及び変異酵素のCDスペクトルを測定した結果, 顕著な差異は見られなかった. 変異による酵素活性の上昇はアミノ酸変異による微少な変化を反映しているものと予想された

LEE Sam-Pin

NGHIEM Ngoc Minh

PHAN Van Chi

SAILAS Benjamin

深澤 親房

荒平 正緒美

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ダイズ種子エポキシド加水分解酵素変異体の作出及びその性質検討著者 荒平 正緒美, SAILAS Benjamin, LEE Sam-Pin,NGHIEM Ngoc Minh, PHAN Van Chi, 深澤 親房雑誌名 食品総合研究所研究報告巻 76ページ 45-50発行年 2012-03-01URL http://doi.org/10.24514/00002891doi: 10.24514/00002891緒 言植物種子の登熟の間に，種子は菌類，細菌，ウィルスなど病原体による攻撃を含む様々な生物的あるいは非生物的環境ストレスにさらされることとなる．植物組織全体の防衛の場合と同様，種子においても環境ストレスに対する防御反応として，種子内に数種の防御タンパク質を合成することが知られている１），２）．種子中で，貯蔵タンパク質よりも多量に発現誘導される場合があるレクチン及びプロテアーゼ阻害タンパク質など，生化学的または分子生物学に比較的よく性質が解明された種子防御関連タンパク質があるが２）－４），これらとは関連のない防御関連タンパク質が，登熟時の様々な環境刺激に反応して生じることが報告されており，一方，これらの発現調節メカニズムの多くが未知のままである．真菌に対する種子の防御のため，天然の殺菌剤と考ダイズ種子エポキシド加水分解酵素変異体の作出及びその性質検討荒平 正緒美，Benjamin Sailas，Sam-Pin Lee，Ngoc Minh Nghiem，Van Chi Phan，深澤 親房独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 食品総合研究所Characterization of soybean epoxide hydrolase mutantMasaomi Arahira, Benjamin Sailas, Sam-Pin Lee,Ngoc Minh Nghiem, Van Chi Phan, and Chikafusa FukazawaNational Food Research Institute, NARO, 2−1−12 Kannnondai, Tsukuba, Ibaraki, Japan, 305−8642AbstractEpoxide hydrolases (EH) catalyze hydrolysis of epoxides to the corresponding vicinal diols. By site-directed muta-genesis, a total of 22 mutants were constructed, followed by analyzing their kinetics. Through these experiments, muta-tion of G32, S39, and D58, located at a highly conserved region of EHs known to date, led to a 2-fold higher specificactivity than that of wild-type.Keywords：epoxide hydrolase, mutant食総研報（Rep. Nat’l Food Res. Inst）No.７６，４５－５０（２０１２）［研究ノート］研究ノート４５えられている物質の中には，様々なエポキシ脂肪酸及びそれらの誘導体が含まれる５）－７）．これらの構成要素となるエポキシドについてはその生合成経路やその分解経路が報告されて来ており，これらの経路を構成する酵素群の１つがエポキシド水解酵素（ＥＨ）である．この酵素はエポキシドに水分子を付加することで，それぞれの分子をジオールに変換する触媒機能を有しており８），ホウレンソウ９），リンゴ１０），及びソラマメ７）から報告されて来た．エポキシド水解酵素活性が最初に見つかったのはソラマメの種子抽出物であるが，その詳細は不明である．一方，ダイズは主要農産物の１つであり，その性質検討は農業にも貢献し得るとの見地から，我々はダイズ種子のエポキシド水解酵素に着目し，既に同酵素の精製，性質検討及び遺伝子のクローニングにも成功し報告をしている１１－１５）．エポキシド水解酵素の相同遺伝子はヒトでも得られており，同遺伝子が種子の環境ストレスだけでなく，多様な機能を有することも示唆されている．そこで，我々は，ダイズ種子エポキシド水解酵素cDNAを大腸菌で発現し，得られた酵素の性質を検討した．さらに，活性のより高い酵素の作出を目的として，ダイズと他の植物やヒトの遺伝子がそれぞれコードするアミノ酸配列の相同性に基づき９ヶ所，２２種類の部位特異的変異を導入し，各種変異酵素の作出を試みた．その結果，６種の変異酵素の獲得に成功し，それぞれの酵素活性及び円二色性スペクトルによる構造情報を比較した．ここでは，その結果を報告する．実験方法発現プラスミドの構築大腸菌を用いてエポキシド水解酵素を生産するために，推定した成熟した酵素のＮ末端（図１に示される第２のメチオニン）に基づく２つのプライマーを合成した．１．（センス側）：NdeIサイト（アンダーラインによって示される）を含む上流側を含んでエポキシド水解酵素の２６から３３アミノ酸残基のコドンと一致するように造られた５’－ATATACATATGGAGCAAATAAAGCACAGAACA－３，２．（アンチセンス側）：EcoRIサイト（アンダーライン）を含む停止コドンと３’非翻訳図１．ダイズ（上段）とヒト（下段）のアミノ酸相同性の比較□で囲んだメチオニンが第２メチオニン４６領域と一致する５’－GGTTGAATTCGT TTTTGGACAAGATCAGAACTTC－３．テンプレートとしてエポキシド水解酵素組み換えプラスミド DNA（pSEH 221）からKpnIで切り出されるフラグメントを精製して用い，PCR法によって増幅した１４）．EcoRIと NdeIで PCR産物を切断し，フラグメントを精製した後，発現ベクターpRSET（インビトロジェン，オランダ）にサブクローニングした．この発現プラスミド（pRSEH 310とする）を E.coli BL21（DE3）に形質転換し，発現実験の親株として用いた１４）．発現プラスミド PRSEH310は，変異を導入するための親プラスミドとして用い，変異体の作製実験を行った．エポシキド水解酵素の部位特異的変異法His31を Phe（H31F）もしくは Lys（H31K）に，Gly32を Ala（G32A），もしくは Cys（G32C），Glu（G32E），Leu（G32L），Asn（G32N），Gln（G32Q），Ser（G32S），Thr（G32T）や，Tyr（G32Y）それぞれに，Phe33を Trp（F33W）に，Phe33Pro34を Pro33Phe34（F33P34 / P33F34）に Glu35を Asp（E35D）もしくは Gln（E35Q）に，Ser39を Ala（S39A）もしくは Leu（S39L），Asn（S39N）や，Thr（S39T）それぞれに，Trp40Arg4１を Arg40Trp41（W40R41 / R40W41）に，Asp58を Glu（D58E）もしくは Asn（D58N）にそれぞれ変換するために部位特異的変異を表１で示したオリゴヌクレオチドを用いて PCR法で行った．最初の PCRサンプルは，以下の条件で増幅：９５℃（４８秒）の変性，５６℃（４８秒）のアニーリング，７２℃（１分）の伸長反応を３０サイクル，最後に７２℃（８分）伸長反応．得られたPCR産物をそれぞれ電気泳動を用いて単離し，カルボキシル端側の２回目の PCR反応を上記と同じ条件で行った．２回目の PCR産物を同様に単離し，pCR2.1ベクタ （ーインビトロジェン，オランダ）にサブクローニングの後，全塩基配列をシークエンサーを用いて確認した．作製したプラスミドは，上記方法で発現ベクター PRSETにサブクローニングし，E-coil（DE3）に形質転換後，発現実験に用いた．エポシキド水解酵素活性の測定法エポシキド水解酵素活性としてエポキシド－ジオール変換活性をスチレンオキシドを基質とし，反応後，生成物のスチレングリコールの量を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定し解析した１４）．円二色性（ＣＤ）スペクトルの測定大腸菌で発現させた酵素タンパク質の構造情報を得るため，Jasco J−800を用いて発現タンパク質のＣＤスペクトルを測定した．測定条件は，タンパク質濃度０．１mg/ml，石英セル長０．０１cm，スキャン範囲２００－２５０nmバンド幅１nm，レスポンス０．５secで実施した．結果および考察大腸菌で発現したエポキシド水解酵素タンパク質クローニングの結果から推定されたエポキシド水解酵素タンパク質（図１）配列の内，２６残基目から３４１残基目にわたっているアミノ酸部分をカバーするよう構築したエポキシド水解酵素発現プラスミド（pRSEH310）を使用することにより，我々は組換え型酵素を生産し，エポキシド－ジオール変換活性を確かめた．表１ 変異体作成用プライマー表２．野生型エポキシド水解酵素と３種の変異体の比活性の比較Mutation SequenceH31F 5’−GAGTACCAGAGCTCAGGGAAGCCTTTGAGG−3’H31K 5’−GAGTACCAGAGCTCAGGGAAGCCAAAGAGG−3’G32A 5’−GAGTACCAGAGCTCAGGGAAGGCGTGGAGG−3’G32C 5’−GAGTACCAGAGCTCAGGGAAGCAGTGGAGG−3’G32E 5’−GAGTACCAGAGCTCAGGGAACTCGTGGAGG−3’G32L 5’−GAGTACCAGAGCTCAGGGAAGAGGTGGAGG−3’G32N 5’−GAGTACCAGAGCTCAGGGAAGTTGTGGAGG−3’G32Q 5’−GAGTACCAGAGCTCAGGGAATTGGTGGAGG−3’G32S 5’−GAGTACCAGAGCTCAGGGAAACTGTGGAGG−3’G32T 5’−GAGTACCAGAGCTCAGGGAATGTGTGGAGG−3’G32Y 5’−GAGTACCAGAGCTCAGGGAAGTAGTGGAGG−3’F33W 5’−GAGTACCAGAGCTCAGGCCAGCCGTGGAGG−3’F33P34/P33F34 5’−GAGTACCAGAGCTCGAAAGGGCCGTGGAGG−3’E35D 5’−GAGTACCAGAGATCAGGGAAGCCGTGGAGG−3’E35Q 5’−GAGTACCAGAGTTGAGGGAAGCCGTGGAGG−3’S39A 5’−CTGATGGCGCCAGGCGTACCAGAGCTCAGG−3’S39L 5’−CTGATGGCGCCAGAGGTACCAGAGCTCAGG−3’S39N 5’−CTGATGGCGCCAATTGTACCAGAGCTCAGG−3’S39T 5’−CTGATGGCGCCATGTGTACCAGAGCTCAGG−3’W40R41/R40W41 5’−CTGATGCCAGCGTGAGTACCAGAGCTCAGG−3’D58E 5’−AGCCACGGAGCTCGGGAGCGACGGCGCGG−3’D58N 5’−AGCCACGGAGGTTGGGAGCGACGGCGCGG−3’Kinetic valuesEHsSpecific activity(µmol/min/mg) % of controlWild Type ３．８６ １００．０G32S ８．５３ ２２１．０S39A ６．６９ １７３．３D58E ８．００ ２０７．３４７野生型エポキシド水解酵素を大腸菌で発現し，菌体破砕後，５５℃１０分間加熱処理を行い，タンパク質画分を４５％硫安沈殿で濃縮後，Sephacryl S-200 HR （直径２．６cm×１００cm）で分離し１４），得られた活性画分を再度同カラムで分離精製するという３ステップの精製過程により，SDS-PAGEおよびウエスタンブロットによって単一になるまで精製した（データー非掲載）．SDS-PAGEおよびウエスタンブロットは文献１４の方法に従った．酵素活性は菌体内に検出され，培養液１Ｌから約１０mgの精製組換え型エポキシド水解酵素が得られた．この酵素は，超遠心平衡分析によって３６，０００の分子量を示し，塩基配列から予想される分子量が３５，９８６．１４であることから，単量体酵素が活性単位であることが明らかとなった．また酵素活性については，文献１４の方法に従い，基質としスチレンオキシドを添加，反応後，生成したスチレングリコールの量を測定した．その結果，組換えダイズエポキシド水解酵素の比活性，kcatと Km値はそれ ぞ れ，３．８６µmol/min/mg，４．３４sec-1，２．５６mMであった．これは文献１４記載の比活性の２．８倍であった．ゲル濾過の過程をもう１つ加えることにより，精製が更に進んだものと考えられた．エポキシド水解酵素変異体の酵素活性活性の高いエポキシド水解酵素変異体の作出を目的として，文献１４に記述してある植物由来酵素との比較および，図１に示すヒト由来のエポキシド水解酵素との間の比較で相同性の高い部分に，変異させるアミノ酸残基の性質を塩基性に変えたものなどの変異を有する２２種の変異体の作製を試みた．その結果，H31変異では可溶性酵素は得られず，G32変異でも，G32Sを除いて，可溶性酵素は得られなかった．更に S39LとD58Nの変異でも同様の結果が得られた．一方，変異体 G32S，E35D，S39A，S39N，S39Tと D58Eでは可溶性酵素が得られた．これらの酵素についてエポシキド水解酵素活性を測定したところ，いずれも野生型より高い比活性を示した．この中で，野生型よりも顕著に活性の高い変異体はゲノム上極めて高度に保存されている領域に変異を有し，野生株の２倍程度までの活性が検出された（表２）．これら残基は酵素の立体構造において，推定される活性残基の近傍にあり，上記変位によって構造が安定することによって活性が上がるのではないかと考えた．また，他の変位の場合は構造が変わり，不溶化するのではないかと考えられた１７）．ＣＤスペクトルの比較結果エポキシド水解酵素の変異が酵素分子のコンフォメーション変化にどのような影響を与えるかを検討するために，野生型と変異型のＣＤスペクトルの比較を行った（図２）．その結果，２００－２５０nmの範囲でのＣ図２．野生型と３種の変異体のＣＤスペクトル条件は実験方法による。（●）野生型；（○）G32S；（▲）S39A；（×）D58E．４８Ｄスペクトルにおいて，野生型と３種の変異体の間で有意な差は見られなかった．また，DSC（示差走査熱量測定）の分析においても有意な差は認められなかった（データー非掲載）．以上の結果から，変異によるエポキシド水解酵素活性の上昇は，分子の大きな構造変化によるものではなく，アミノ酸変異による微細な変化が反映するものと推定された．基質との相互作用への影響等，活性変化の原因の解明は今後の課題である．要 約エポキシド水解酵素は，エポキシドを加水分解し，ジオールに変換する触媒作用を示す．ダイズエポキシド水解酵素の２２種の部位特異的変異体の作出を試み，６種の可溶性変異酵素が得られた．得られた変異酵素の内，ゲノム上極めて高度に保存されている領域に変異を有する３種の酵素については，野生型酵素の２倍近い酵素活性が得られた．野生型酵素及び変異酵素のＣＤスペクトルを測定した結果，顕著な差異は見られなかった．変異による酵素活性の上昇はアミノ酸変異による微少な変化を反映しているものと予想された．参考文献１）Ryan, C.A. & Jagendorf, A. 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ダイズ種子エポキシド加水分解酵素変異体の作出及びその性質検討

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