Centonze, Diego

Eugenio Chiaravalle, Antonio

Iammarino, Marco

Mangiacotti, Michele

Mentana, Annalisa

Palermo, Carmen

Marco Iammarino

Annalisa Mentana

Diego Centonze

Carmen Palermo

Michele Mangiacotti

Antonio Eugenio Chiaravalle

Archivio Istituzionale della Ricerca- Università degli Studi di Foggia

XIX Congresso Nazionale S.I.Di.L.V.Matera 23-25 Ottobre 2019Hotel MH MateraVOLUME DEGLI ABSTRACTSOCIETÀ ITALIANA DI DIAGNOSTICA DI LABORATORIO VETERINARIA178Matera 23-25 Ottobre 201935SVILUPPO E APPLICAZIONE DI UN METODO ANALITICO MEDIANTE HPLC-UV-DAD PER LA SIMULTANEA DETERMINAZIONE DI 12 COLORANTI NELLE CARNI FRESCHE E NEI PRODOTTI A BASE DI CARNEIammarino M.*[1], Mentana A.[2], Centonze D.[2], Palermo C.[2], Mangiacotti M.[1], Chiaravalle A.E.[1][1]Struttura Complessa “Chimica”, Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata ~ Foggia ~ Italy, [2]Dipartimento di Scienze Agrarie degli Alimenti e dell’Ambiente, Università degli Studi di Foggia ~ Foggia ~ ItalyKeywords: Food dyes, HPLC/UV-DAD, validation SUMMARY: The use of food dyes in meat is regulated by the actual Normative, due to food safety concerns. Three food dyes are admitted in some types of meat products, and maximum admissible levels were established in the Regulation No. 1129/2011/EC. Furthermore, the presence of some dyes, including carcinogens, was found in spices used in meat products production. In this work, an accurate method based on high performance liquid chromatography with UV-diode array detection was developed for the simultaneous determination of 12 dyes (Amaranth, Ponceau 4R, Carmine, Ponceau SX, Ponceau 3R, Allura Red AC, Carmoisine, Erythrosine, Sudan I, Sudan II, Sudan III and Sudan IV) in meat products. Good analytical performances were obtained, in terms of selectivity, sensitivity, accuracy and ruggedness. Both method precision and recovery percentages resulted in compliance with the Decision No. 657/2002/EC. The method was also applied for the determination of 12 dyes in commercial meat products, successfully.INTRODUZIONE: La problematica relativa concernente l’mpiego di coloranti nei prodotti carnei è molto complessa. La legislazione Europea consente l’aggiunta di soli tre coloranti nei prodotti carnei: Carmine (E120), Ponceau 4R (E124) ed Allura Red AC (E129), con precise restrizioni, in quanto alcuni di questi possono provocare reazioni avverse sull’uomo. Oltre questi aspetti, la Commissione Europea, nell’External Scientific Report del 2013 dal titolo: “Analysis of needs in post-market monitoring of food additives and preparatory work for future projects in this field”, ha evidenziato alcune lacune per quanto riguarda i metodi analitici standard, i monitoraggi sui prodotti in commercio ed altri aspetti legislativi, relativi ai coloranti alimentari, in differenti prodotti. In effetti, sono davvero pochissimi i dati in letteratura relativi all’impiego di coloranti nelle carni. Questa lacuna è dovuta principalmente al fatto che non sono disponibili metodi analitici in grado di determinare simultaneamente i più importanti coloranti, ammessi e non, che possono essere utilizzati, anche in modo fraudolento, nelle preparazioni di carne. In questo studio è stato messo a punto e validato un nuovo metodo analitico mediante HPLC-UV/DAD in grado di identificare e quantificare 12 coloranti nelle carni fresche e nei prodotti carnei. Tale metodo è stato quindi impiegato per svolgere un monitoraggio sui prodotti carnei in commercio al fine di valutare l’effettivo impiego e l’eventuale abuso di coloranti in tali prodotti.MATERIALI E METODI: Lo sviluppo del metodo analitico ha riguardato sia la separazione cro-matografica dei coloranti che la fase preparativa del campione. È sta-to impiegato un sistema cromatografico HPLC WatersTM 2690, corre-dato da un detector WatersTM 996 PDA. La Colonna cromatografica impiegata è stata una C18 RP Hypersil GoldTM (5μm, 150 × 4.6mm), con relativa pre-colonna. Tenendo in considerazione i dati in lettera-tura sono stati confrontati diversi gradienti di eluizione a base di ac-qua, acetonitrile, metanolo e tamponi a pH acido e neutro. Il segnale è stato acquisito a 520 nm in quanto a questa lunghezza d’onda assor-bono bene tutti i coloranti presi in considerazione e, al tempo stesso, non vengono rilevati interferenti significativi provenienti dalla carne. La fase di estrazione e purificazione del campione è stata ottimizzata confrontando le percentuali di recupero dei coloranti ottenute trat-tando il campione con diverse tecniche di estrazione, quali bagno ad ultrasuoni, vortex, agitatore magnetico e bagnomaria. Allo stesso modo, sono state testate diverse miscele di estrazione a base di ac-qua, metanolo, ammoniaca ed acetonitrile, ovvero i solventi idonei alla solubilizzazione dei coloranti testati. Completata l’ottimizzazione del metodo è stata sviluppata la validazione, valutando i seguenti pa-rametri analitici per ogni colorante: linearità, selettività, LOD e LOQ, accuratezza (precisione e recupero), robustezza (campo di applicazio-ne) ed incertezza di misura. Sono stati infine analizzati una serie di campioni, con e senza coloranti dichiarati in etichetta, per valutare sia gli effettivi livelli di impiego che le eventuali aggiunte non consentite.RISULTATI E DISCUSSIONE: La completa ed efficiente separazione dei 12 coloranti è stata ottenuta mediante gradiente tampone acetato 0.02 M, pH 7.0 (fase A) ed ace-tonitrile (fase B), con un flusso 1.2 mL/min, iniettando 10 µL di cam-pione (durata corsa cromatografica: 52 minuti). https://secure.online-congress.it/downloadfile/7747432414442852861026557/80419_1.jpg Impostando il rivelatore con un range di acquisizione del segnale 200-600 nm è stato possibile registrare l’intero spettro di assorbi-mento, che è caratteristico di ogni colorante. È stata aumentata così, notevolmente, la selettività del metodo. Una ottimale estrazione dei coloranti è stata ottenuta impiegando una miscela acetonitrile, meta-nolo, acqua, ammoniaca 50:40:9:1 (v/v/v/v) (2g di campione in falcon da 50 mL + 20 mL di miscela) ed utilizzando in sequenza il vortex (2’), il bagno ad ultrasuoni (40°C, 100 Hz, 90’) e nuovamente il vortex (1’). Circa 2 mL di surnatante sono stati quindi filtrati (filtri 0.2 µm) in vial ed iniettati. Tutti i parametri di validazione ed i risultati ottenuti dalle prove di fortificazione sono riportati nella Tabella 1. https://secure.onlinecon-gress.it/downloadfile/7747432414442852861026557/80419_0.jpgLe performances analitiche sono risultate idonee allo scopo. Il me-todo analitico garantisce la sensibile, selettiva ed accurata deter-minazione quali/quantitativa di 12 coloranti nelle carni fresche e nei prodotti carnei (1,2). relativamente al monitoraggio effettuato su campioni di preparazioni di carni fresche e prodotti carnei, sono stati identificati solo due coloranti: Carmine e Ponceau 4R. Nei pro-dotti carnei tali coloranti sono ammessi e le concentrazioni sono risultate entro i limiti. https://secure.onlinecongress.it/downloadfi-le/7747432414442852861026557/80419_2.jpg Nelle preparazioni di carni fresche non sono ammessi i coloranti, tuttavia la presenza di Carmine è stata verificata in alcuni campioni, confermando la necessi-tà di svolgere un numero adeguato di controlli onde prevenire questo tipo di irregolarità (3). Lavoro svolto grazie al finanziamento del Ministero della salute, progetto GR-2013-02358862. 179Matera 23-25 Ottobre 2019 Tabella - Parametri di validazione del metodo analitico sviluppato in questo studio  Separazione cromatografica dei 12 coloranti testati (miscela standard 5.0 mg/L)180Matera 23-25 Ottobre 2019BIBLIOGRAFIA: 1. IAMMARINO M., MENTANA A., CENTONZE D., PALERMO C., MANGIACOTTI M., CHIARAVALLE A.E. (2019). Simultaneous determination of twelve dyes in meat products: Development and validation of an analytical method based on HPLC-UV-diode array detection. Food Chem, 285, 1-9. 2. IAMMARINO M., MENTANA A., CENTONZE D., PALERMO C., MANGIACOTTI M., CHIARAVALLE A.E. (2019). Chromatographic determination of 12 dyes in meat products by HPLC-UV-DIODE array detection. MethodsX, 6, 856-861.  3. IAMMARINO M., MENTANA A., CENTONZE D., PALERMO C., MANGIACOTTI M., CHIARAVALLE A.E. (2019). Dye use in fresh meat preparations and meat products: a survey by a validated method based on HPLC-UV-diode array detection as a contribution to risk assessment. Int J Food Sci Tech, in press, DOI: 10.1111/ijfs.1427. (A) Campione di salame: [Carmine]: 115.2 ± 7.5 mg/kg; (B) Campione di Chorizo: [Ponceau 4R]: 8.1 ± 1.1 mg/kg SVILUPPO E APPLICAZIONE DI UN METODO ANALITICO MEDIANTE HPLC-UV-DAD PER LA SIMULTANEA DETERMINAZIONE DI 12 COLORANTI NELLE CARNI FRESCHE E NEI PRODOTTI A BASE DI CARNEMarco Iammarino1*, Annalisa Mentana2, Diego Centonze2, Carmen Palermo2, Michele Mangiacotti1, Antonio Eugenio Chiaravalle11 Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata, Via Manfredonia 20, 71121 Foggia, Italia2 Dipartimento di Scienze Agrarie degli Alimenti e dell’Ambiente, Università di Foggia, Via Napoli, 25, 71122 Foggia, ItaliaLa legislazione Europea consente l’aggiunta di soli tre coloranti neiprodotti carnei: Cocciniglia (E120), Ponceau 4R (E124) ed Allura RedAC (E129), con precise restrizioni in quanto alcuni di questi possonocausare reazioni avverse sull’uomo. La Commissione Europea, nel2013, ha evidenziato alcune lacune per quanto riguarda i metodianalitici standard, i monitoraggi sui prodotti in commercio ed altriaspetti legislativi, relativi ai coloranti nei prodotti alimentari. Perquanto concerne i prodotti carnei, sono davvero pochissimi i datidisponibili in letteratura riguardanti l’impiego di coloranti, in quantonon sono disponibili metodi analitici in grado di determinaresimultaneamente i più importanti coloranti che possono essereutilizzati in tali prodotti. In questo studio, un nuovo metodo analiticomediante HPLC/UV-DAD, è stato impiegato per valutare l’attualeimpiego di tali additivi sia nelle preparazioni di carni che nei prodotticarnei. Il monitoraggio si è concluso con il contributo alla valutazionedel rischio associato.CONCLUSIONEÈ stato impiegato un nuovo metodo analitico mediante HPLC/UV-DAD, sviluppato e validato per la simultanea determinazione di 12coloranti: Amaranth S, Ponceau 4R, Carmine, Ponceau SX, Ponceau3R, Allura Red AC, Carmoisine, Erythrosine, Sudan I, Sudan II,Sudan III e Sudan IV [1, 2] (Fig.1-2) per monitorare l’impiego di taliadditivi nelle preparazioni di carni fresche e nei prodotti carnei. 130campioni (65 preparazioni di carni fresche e 65 prodotti carnei) sonostati prelevati presso esercizi commerciali locali e negozi onlinespecializzati in salami “Spanish-type”, secondo il criterio dellacasualità (Fig.3). Il monitoraggio ha consentito di valutare sia latipologia che il livello di colorante impiegato nei vari prodotti,nonchè eventuali “non conformità”. L’indagine si è conclusa con ilcontributo al “Risk Assessment”.Figura 3 – Piano di campionamento*Corresponding author: marco.iammarino@tin.it marco.iammarino@izspb.itFigura 1 – Tipico cromatogramma HPLC dei 12 coloranti oggetto di ricercaFigura 5 – Riepilogo campioni non conformiFigura 4 – Campione di salame “Spagnolo” ([Carmine]: 40.9 mg kg-1) (A);Campione di “Chorizo” ([Ponceau 4R]: 8.1 mg kg-1) (B)LAVORO SVOLTO GRAZIE AL FINANZIAMENTO DEL MINISTERO DELLA SALUTEPROGETTO GR-2013-02358862L’impiego di coloranti nelle carni è risultato molto limitato sia in termini quantitativi che qualitativi. Tuttavia, si sonoverificati casi di campioni di preparazioni di carmi fresche (hamburger, carni trite e salsicce fresche) nei quali il Carmine(E120) viene ancora addizionato, nonostante non sia più consentito. Pertanto, è auspicabile l’intensificazione dei controllisui coloranti nelle carni, onde prevenire questo tipo di “non conformità”.RISULTATI E DISCUSSIONEPonceau 4R e Carmine sono stati gli unici coloranti identificati nel corso delmonitoraggio (Fig.4). Ad eccezione di un campione di salame, tali additivierano regolarmente indicati in etichetta e le loro concentrazioni (nei range 1.3-8.1 e 6.2-86.4 mg kg-1 rispettivamente per Ponceau 4R e Carmine) rientravanonei rispettivi limiti di legge. Il Carmine è stato quantificato in 3 campioni dipreparazioni di carni fresche (un hamburger ed una carne trita bovino/suino euna salsiccia fresca suina) (Fig.5). In tali prodotti l’impiego di coloranti non èconsentito, dunque, si evidenzia la necessità di effettuare più controlli ariguardo. Per quanto concerne la valutazione del rischio associato, l’apportogiornaliero risulta inferiore all’1% della DGA per entrambi i coloranti [3].INTRODUZIONEMATERIALI E METODIFigura 2 – Campione di salame“Spagnolo” prima (A) e dopo (B)l’estrazione dei colorantiREFERENCESIAMMARINO M., MENTANA A., CENTONZE D., PALERMO C., MANGIACOTTI M., CHIARAVALLE A.E. (2019). “Simultaneous determination of twelve dyes in meat products: development and validationof an analytical method based on hplc-uv-diode array detection”. Food Chemistry, 285, 1-9.IAMMARINO M., MENTANA A., CENTONZE D., PALERMO C., MANGIACOTTI M., CHIARAVALLE A.E. (2019). “Chromatographic determination of 12 dyes in meat products by hplc-uv-diode arraydetection”. MethodsX, 6, 856-861.IAMMARINO M., MENTANA A., CENTONZE D., PALERMO C., MANGIACOTTI M., CHIARAVALLE A.E. (2019). “Dyes use in fresh meat preparations and meat products: a survey by a validated methodbased on HPLC-UV-Diode array detection as a contribution to risk assessment”. International Journal of Food Science and Technology, in press. DOI: 10.1111/ijfs.14275N° campioni non conformi: 4° ca pioni non confor i: 4Presenza di Carmine (non dichiarato in etichetta)Presenza di Carmine (non autorizzato)N° campioni non conformi: 4PRODOTTI CARNEI (65)PREPARAZIONI DI CARNI FRESCHE (65)Carni macinateSalsiccia frescaHamburgerSalameSalsiccia stagionata

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Sviluppo e applicazione di un metodo analitico mediante HPLC-UV-DAD per la simultanea determinazione di 12 coloranti nelle carni fresche e nei prodotti a base di carne

Sviluppo e applicazione di un metodo analitico mediante HPLC-UV-DAD per la simultanea determinazione di 12 coloranti nelle carni fresche e nei prodotti a base di carne

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