Clausen, Rasmus Prætorius

Riise, Erik

Skottrup, Peter Durand

Danish

Copenhagen University Research Information System

u n i ve r s i t y  o f  co pe n h ag e n  Københavns UniversitetNanobodies fra kameler - En ny klasse antistoffer til diagnostik og behandlingSkottrup, Peter Durand; Clausen, Rasmus Prætorius; Riise, ErikPublished in:LægemiddelforskningPublication date:2011Document versionTidlig version også kaldet pre-printCitation for published version (APA):Skottrup, P. D., Clausen, R. P., & Riise, E. (2011). Nanobodies fra kameler - En ny klasse antistoffer tildiagnostik og behandling. Lægemiddelforskning, 2011, 4-6.Download date: 02. Feb. 20204 l æ g e m i d d e l f o r s k n i n g  –  2 0 1 1Nanobodies         fra kamelerDyr i kamelfamilien danner specielle antistoffer i blodet, hvorfra man kan konstruere små fragmenter, som kaldes nanobodies. De små antistofdele har unikke egenska-ber, som gør dem meget anvendelige som lægemidler og til diagnostik. Vi har udviklet et nanobody, der kan detektere en bakterie, som medfører paradentose.Af Peter Durand Skottrup, Rasmus Prætorius Clausen  og Erik RiiseAntistoffer er en del af kroppens immunforsvar, som beskyt-ter os mod bakterier, svampe og virus, men nu udvikles anti-stoffer i stigende udstrækning som lægemidler og til diag-nosticering af sygdomme. I begge tilfælde udnytter man, at antistoffer kun binder sig til ét bestemt målmolekyle, som kaldes for antigenet. Ved medicinsk behandling er antigenet typisk et protein i kroppen, som lægemidlet skal påvirke, og ved diagnostik kan antigenet fx være et protein, som er spe-cifikt for en sygdomsfremkaldende mikroorganisme. Mange farmaceutiske antistoffer fremstilles ved hjælp af en teknik, hvor man fusionerer en antistofproducerende celle og en kræftcelle. Derved får man en cellelinie, som konstant vokser via celledeling, og hvor alle cellerne danner antistof-fet. Men desværre er der ulemper ved metoden. Antistof-fer kan være ustabile, og samtidig er de ofte store mole kyler, der kan have svært ved at trænge ind til deres antigen, som kan være væv dybt inde i kroppen. Desuden er det både vanskeligt og kostbart at dyrke cellelinier. Småt er godtDerfor produceres antistoffer også i gensplejsede bakterier. Her behøver man ikke få dannet hele antistoffet, fordi man selv bestemmer, hvor stor en del af genet for antistoffet, man vil klone og indsætte i bakterien. På den måde kan man fremstille et mindre og mere stabilt antistoffragment, som stadig besidder de dele, som er nødvendige for, at antistoffet kan genkende og binde sig til sit antigen. Antistoffer er proteiner, der består af aminosyrer, som danner to tunge kæder og to lette kæder. Den struktur af antistof-fet, der binder antigenet, befinder sig i de yderste domæner af disse kæder. Forskere og medicinalfirmaer, som fremstiller antistoffer i bakterier, nøjes derfor med at klone de antigen-bindende domæner af kæderne. Det er nemlig tilstrækkeligt til, at det formindskede antistof kan binde sig til det antigen, som det skal detektere ved diagnostik eller påvirke medicinsk.Undersøgelser har imidlertid vist, at det primært er den  tunge kæde i det antigen-bindende domæne af antistoffet, som er vigtig for bindingen til antigenet, så for at få et end-– en ny klasse antistoffer       til diagnostik og behandling5d e t  f a r m a c e u t i s k e  f a k u l t e t ,  k ø b e n h a v n s  u n i v e r s i t e tnu mindre, men fuldt funktionsdygtigt fragment, har man uden held forsøgt at fremstille antistoffer, som kun består af det relevante domæne af den tunge kæde. Når det ikke er lykkedes, skyldes det, at disse domæner er meget ustabile, når man forsøger at fremstille dem uden tilstedeværelse af det tilsvarende domæne fra den lette kæde. Naturens minimalismeSom så ofte før har det nu vist sig, at naturen selv har fun-det på en løsning, idet så forskellige dyr som kameler og ha-jer danner specielle antistoffer, som adskiller sig fra normale antistoffer ved kun at have to tunge kæder. Tung-kæde-anti-stoffernes antigen-bindende domæner er markant forskellige fra normale antistoffers i flere afgørende aminosyrepositio-ner. Det gør domænet meget stabilt, når det klones og pro-duceres alene. Det antigen-bindende domæne af kamelens antistoffer kaldes for et nanobody. De små nanobodies har typisk en udstrækning på kun 4x3 nanometer, og det øger deres evne til at trænge ind til antigener i kroppen.Tilmed har nanobodies endnu en interessant egenskab, fordi de binder til antigenet på en helt unik måde. Normale anti-stoffer fanger antigenet i en konkav lomme, men det er om-vendt for nanobodies, hvor de bindende aminosyrer udgør en konveks spids, som kan passe ind i en kløft på antigenet (se ill. side 6). Man forventer derfor at kunne finde antistoffer mod antigener, som vi ikke har antistoffer mod i det traditionelle antistofsystem. Specielt er det interessant at identificere nano-bodies, som kan hæmme enzymer og receptorer ved at binde i områder, hvor der ikke er adgang for almindelige antistoffer.Hurtig identifikation af bakterierNanobodies er også lovende til detektion af sygdomsfremkal-dende bakterier. At skelne mellem ufarlige og farlige bakterier med antistoffer er særdeles attraktivt i situationer, hvor det er vigtigt at stille en korrekt diagnose hurtigt og præcist; fx på hospitaler, i fødevareproduktionen eller på lægens kontor. Det er dog tit vanskeligt at udvikle antistoffer, som er tilstræk-kelig specifikke, fordi mange bakterier danner de samme over-fladeproteiner, hvilket medfører risiko for fejldiagnoser. Ved at udnytte den specielle konvekse antigen-bindende struktur i nanobodies, kan man fange antigener, som er dybere begra-vet under bakteriers overflade, og på den måde opnå en mere specifik detektion. Derfor kan nanobodies blive en vigtig del af fremtidige tests for sygdomsfremkaldende bakterier.I vores laboratorium har vi udviklet et stort bibliotek af nano-bodies ud fra kamelblod. Biblioteket indeholder kamel blodets naturlige antistoffer og kaldes ’naivt’, fordi kamelen ikke blev immuniseret, inden blodet blev aftappet. Vi har konstru-eret biblioteket således, at de enkelte nanobodies bliver præ-senteret på overfladen af bakteriofager, som er virus, der in-ficerer bakterier. Biblioteket består af millioner af fager, som hver især præsenterer et enkelt nanobody på  overfladen, samtidig med at det kodende DNA for det pågældende anti-stof er indbygget i viruspartiklens genom. Denne teknik giver en enestående mulighed for hurtig isolering af et bindende nanobody til et givet antigen.Diagnostik af paradentoseI et af vores projekter udvikler vi metoder til at detekte-re bakterier, der forårsager paradentose. Paradentose kal-des de løse tænders sygdom og rammer en stor del af den voksne befolkning. Forløbet starter typisk midt i 30’erne, og sygdommen skrider langsomt frem. Paradentose skyldes, at  bakterier nedbryder de knogler, som tænderne er hæftet fast i, indtil tænderne med tiden begynder at løsne sig. Behand-lingen består af hyppige tandlægebesøg, grundig mund-hygiejne og antibiotikabehandlinger. Paradentose kan også i sjældne tilfælde forekomme hos Til venstre ses strukturen af et almindeligt antistoffragment, som består af to tunge kæder (rød) og to lette kæder (blå). De gule yder områder er den del af antistoffet, som binder antigenet. Bindingsområdet har en konkav form, og det fanger antigenet som et par kæber, der klapper sammen om sit bytte. Til højre ses et nanobody, der kun består af de tunge kæder. Den antigenbin-dende del har en konveks form, og denne top passer ind i en kløft på antigenet.– en ny klasse antistoffer       til diagnostik og behandling6 l æ g e m i d d e l f o r s k n i n g  –  2 0 1 1Ph.d. Peter Durand Skottrup er postdoc på Institut for Farmakologi og FarmakoterapiPh.d. Rasmus Prætorius Clausen er lektor på Institut for Molekylær LægemiddelforskningPh.d. Erik Riise er lektor på Institut for Farmakologi og FarmakoterapiKONVENTIONELLE ANTISTOFFER OG NANOBODIESAlmindelige antistoffer er større og mere komplekse end de små nanobodies, som udmærker sig ved at binde sig til deres antigen på en helt speciel måde.A  Konventionelle antistoffer er opbygget af to identiske lette kæder og to identiske tunge kæder. De lette kæder er hver især bundet til en tung kæde med svovlbroer, og de to tunge kæder er ligeledes bundet til hinanden med svovl-broer. Tilsammen ligner antistoffets struktur et Y. Den yder-ste del af de tunge og lette kæder kaldes tilsammen for Fab- delen og udgør bindingsstedet for et antigen. Dvs. at forskellen mellem to antistoffer ligger i strukturen af det bindende domæne, mens resten er næsten ens. Variatio-nen i Fab- delen, som afgør, hvilket antigen antistoffet kan binde, ligger i tre områder, der kaldes CDRs (Complementary  Determing  Regions). B  Antistoffer i kamelen mangler den lette kæde, og deres bindende domæne kaldes et nanobody. Dette nanobody kan klones ind i et fag-bibliotek. Ud fra 10 ml blod fra en kamel i Københavns Zoologiske Have har vi lavet et stort ’naivt’  nanobody fag-bibliotek med ca. 70 millioner kloner, som kan bruges til at isolere nanobodies mod forskellige proteiner i menneskekroppen eller fra bakterier. C  Nanobodies binder i dybe lommer på antigener. Det skyldes deres specielle konvekse struktur, som bruges til bindingen.børn, og her kan der være tale om en speciel form af syg-dommen, hvor knoglenedbrydningen går ekstra hurtigt, hvil-ket kræver mange og omfattende behandlinger. Endelig har den nyeste forskning vist, at paradentose kan føre til andre lidelser i kroppen, især hjerte-kar-sygdomme, sukkersyge og leddegigt. Derfor er en hurtig og præcis detektion af para-dentosebakterier vigtig for at kunne identificere sygdommen på et tidligt tidspunkt, så en korrekt behandling kan blive sat i værk. Desuden kan en sådan test bruges til at måle effek-ten af antibiotikabehandlinger.Måling i spytprøverI mundhulen findes der hundredevis af forskellige bakterier, men kun en lille gruppe forårsager paradentose. En af de værste hedder Porhyromonas gingivalis, og denne bakte-rie producerer som den eneste et proteaseenzym – RgpB – som nedbryder knoglevævet omkring tanden. Vi har derfor valgt at benytte RgpB som en specifik biomarkør for denne  patogene bakterie. Vi brugte vores bibliotek til at isolere et nanobody, der bin-der sig til enzymet, og det udvalgte nanobody blev efter-følgende anvendt til at udvikle en test til specifik detektion RgpB på overfladen af P. gingivalis. Testen kan foretages i spytprøver, hvilket gør det nemt at få biologisk materiale fra patienten til undersøgelsen. Vores metode kan poten-tielt overføres til en nem og hurtig test i stil med en gravi-ditetstest. Det vil give tandlægen et nyttigt redskab, som kan bruges i klinikken, og som ikke er afhængig af stort og kompliceret laboratorie udstyr.   Udover dette projekt arbejder vi målrettet med at udnytte nanobody-teknologien til at udvikle lægemidler rettet mod receptorer i centralnervesystemet til behandling af psykia-triske lidelser, til at neutralisere enzymer, som er involveret i kræft, samt til at bekæmpe skadelige bakterielle enzymer. SvovlbroDet antigenbindende områdeTung kædeTung kædeLet kæde FABCDRASvovlbroTung kædeNanobodyBNormalt anitistofAntigen AntigenNanobodyC

Nanobodies fra kameler - En ny klasse antistoffer til diagnostik og behandling

https://curis.ku.dk/ws/files/35942740/Kamelnanobodies.pdf

Nanobodies fra kameler - En ny klasse antistoffer til diagnostik og behandling

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Copenhagen University Research Information System