It is the aim of the work described in this thesis to isolate and characterize

human genes involved DNA excision repair. This will facilitate the understanding

of the mechanism of this repair process whereas it also provides an

important step to better understand the relationship betwe

Duin, M. (Michel) van

It is the aim of the work described in this thesis to isolate and characterize

human genes involved DNA excision repair. This will facilitate the understanding

of the mechanism of this repair process whereas it also provides an

important step to better understand the relationship between DNA damage

and carcinogenesis.

Many attempts to complement the genetic defect in XP by genomic DNA

transfer have failed which is most likely due to the poor transfectability of

human cells. In contrast to XP cells, UV- sensitive Chinese hamster ovary

(CHO) mutants are more suitable for genomic transfection which renders it

possible to isolate the human excision repair cross complementing (ERCC)

genes that correct the CHO mutations.

The isolation of these genes opens the possibility to unravel the complex

mechanism of DNA excision repair. In addition, it is still hoped that part

of the spectra of rodent and human UV- sensitive cells overlap. In that case

the cloning of ERCC-genes by genomic transfections with CHO mutants

might at the same time aid the elucidation of the genetic defects in XP. The

experimental work described in this dissertation concerns the cloning and

chara.cterization of the first human DNA repair gene, designated ERCC-1,

which complements the UV and mitomycin-C sensitivity of CHO mutants of

complementation group 1. The ERCC-1 gene was cloned after cotransfection

of high molecular weight human DNA with a dominant marker Ecogpt

to CHO mutant 43-3B. The linked transfer of the ERCC-1 and the Ecogpt gene in the second round of transfection a.llowed the isolation of the ERCC-1

gene from a genomic cosmid library using a probe from the dominant marker.

Correction of the repair deficient phenotype of 43-3B cells by transfection of

cosmid 43-34 confirmed the cloning of ERCC-1 (Appendix paper 1). Using

single copy probes from cosmid 43-34 the human ERCC-1 eDNA was isolated

and in subsequent experiments human ERCC-1 eDNA probes allowed the

cloning of the mouse ERCC-1 gene and eDNA. The results on the characterization

of the human and murine ERCC-1 genes are described in Appendix

papers II, III and IV

Erasmus University Digital Repository

Stellingen behorend bij het proefschrift Cloning and characterization of the human DNA-excision repair gene ERCC-1. I ERCC-1 is een DNA herstelgen. Dit proefschrift II Het uitgebreid karakteriseren van nieuwe DNA herstelmutanten door middel va.n comple-mentatie analyse en het bepalen van de kruisgevoeligheid voor andere DNA-beschadigende agentia voorkomt een overschatting van het aantal genen dat betrokken is bij DNA her-stelprocessen. III Het is zeer onwaarschijnlijk dat de gerapporteerde correctie van het genetisch defect in primaire fibroblasten van Fanconi's anemie patienten veroorzaakt is door de overdracht van het wild type gen in genomische transfecties. Diatloff-Zito et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83,7034 {1986). Shaham et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84, 5853 {1987). IV Teneinde sequentiegegevens van UV-geinduceerde mutaties te kunnen associeren met het proces van zonlicht gelnduceerde carcinogenese, verdient het de voorkeur om deze in vitro experimenten uit te voeren met UV-licht van een biologisch relevante golflengte. Bredberg et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83, 8273 {1986). Drobetsky et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84, 9103 {1987). Brash et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84, 3782 {1987). v Er zijn aanvullende experimenten nodig, voordat gesteld kan worden dat de afwijkende immunoreactiviteit van een monoklonaal antilichaam tegen het uracil DNA glycosylase van Bloom's syndroom patienten gebruikt kan worden voor het opsporen van heterozy-goten. Vollberg et al., Carcinogenesis 8, 1725 {1987). Seal et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85, 2339 {1988). VI Het door Yamaizumi et al. gerapporteerde molecuulgewicht voor de XP-A corrigerende factor is niet in overeenstemming met de grootte van het XP-A mRNA en gezien de ge-volgde procedure waarschijnlijk onjuist. Yamaizumi et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83, 1476 {1986). Legerski et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81, 5676 {1984). VII Het verdient aanbeveling om bij het maken van nieuwe DNA- hersteldeficiente mutanten uit te gaan van cellijnen met een hoge transfectie-effi.cientie en DNA-opname capaciteit. VIII Doordat Chen en Okayama het gemodificeerde calciumfosfaat transfectieprotocol niet vergeleken hebben met het oorspronkelijke protocol, is het voorbarig te stellen dat de modificaties ten grondslag liggen aan de geclaimde hogere transfectie-efficientie. Chen en Okayama, Mol. Cell. Biol. 7, 2745 (1987). IX De isolatie van defecte genen in UV-gevoelige rad mutanten van Schizosaccharomyces pombe kan een belangrijke bijdrage leveren aan de klonering van de homologe humane DNA-excisie herstelgenen. Phipps et al., Adv.in Genet. 23, 1 (1985). Russell en Nurse, Cell 45, 781 (1986). X De evolutionaire conservering van Drosophila 'scaffold-associated regions' (SARs) en de associatie van de lokatie van SARs met aktief overgeschreven genen suggereren dat geklo-neerde SARs nuttig gebruikt kunnen bij het bewerkstelligen van een maximale expressie van getransfecteerd DNA. Gasser en Laemmli, Trends Genet. 3, 16 (1987). Mirkovitch et al., J.Mol.Biol. 200, 101 (1988). Izaurralde et al., J.Mol.Biol. 200, 111 (1988). XI De namen van de E.coli proteases Do, Re, Mi, Fa, So, La, Ti etc. klinken na vergeefse pogingen om een eiwit in deze bacterie te overproduceren niet meer als muziek in de oren. Sreedhara en Goldberg, Nature 292, 652 (1981). XII Ret streven om in 1992 binnen de EUR op iedere werkplek een 'werkstation' c.q. personal computer beschikbaar te hebben lijkt slechts haalbaar door een ruime interpretatie van het begrip werkplek. Computerbeleidsplan EUR, 1988-1992. XIII De thans in polisvoorwaarden van autoverzekeringen opgenomen clausule, dat 'no-claim'-korting wordt verlaagd bij inbraakschade, leidt tot een kunstmatige verhoging van het eigen. risico en rechtvaardigt het niet om nog langer over 'all risk' verzekeringen te spreken. Rotterdam, 2 november 1988 .. M. van Duin. 

Cloning and characterization of the human DNA-excision repair gene ERCC-1

http://repub.eur.nl/pub/51060/stellingen-Van-Duin.pdf

Cloning and characterization of the human DNA-excision repair gene ERCC-1

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Erasmus University Digital Repository