Fekete, E.

Irinyi, László Miklós

Karaffa, Erzsébet Mónika

Karaffa, L.

Kövics, György

Seiboth, B.

Repository of the Academy's Library

  232 RIPORTER RENDSZER LÉTREHOZÁSA A TRICHODERMA REESEI PEPTAIBOL SZINTETÁZ EXPRESSZIÓJÁNAK ANALÍZISÉHEZ  Sándor Erzsébet1 – Bernhard Seiboth2 – Karaffa Levente3 – Fekete Erzsébet3 – Irinyi László1 – Kövics György J.1 – Christian P. Kubicek2   1Debreceni Egyetem, Agrártudományi Centrum, Mezgazdaságtudományi Kar, Növényvédelmi Tanszék 2TU Vienna, Institute of Chemical Engineering, Division Applied Biochemistry and Gene Technology, Austria 3Debreceni Egyetem, Természettudományi Kar, Mikrobiológiai és Biotechnológiai Tanszék  Bevezetés, Irodalmi áttekintés  A Trichoderma nemzetségbe tartozó talajlakó fonalas gombákat több mint 70 éve tanulmányozzák. Ennek oka részben az, hogy a növénypatogén gombák elleni biológiai védekezés (biokontroll) talán legígéretesebb fegyvereinek számítanak (Kubicek és mtsai, 2001). Napjainkban már kereskedelmi forgalomban is kaphatók különböz Trichoderma törzseket tartalmazó készítmények (pl. PlantShield HC, Trichodex, Soilgard 12G, Primastop), melyek elvileg lehetséget adnak a fungicid-hatású vegyszerek mellzésére, vagy csökkentett mérték használatára (Hjeljord és Tronsmo, 1988).  A növénykórokozók elleni biológiai védekezés a növénytermesztésben vonzó alternatívája a kemikáliák használatának, amely gyakran környezetszennyezési problémákkal jár, ráadásul egyre gyakrabban figyelhet meg a különböz fungicidekkel szemben rezisztens törzsek megjelenése is. Számos T. harzianum törzset tartalmazó biopeszticidet használnak a biológiai védekezésben, mivel hatékony parazitája sok gazdaságilag fontos növénypatogén gombának (pl. Rhizoctonia solani, Fusarium spp., Pytium spp., Botrytis cinerea). A biokontroll törzsek alkalmazásának hatékonyságát nem könny megjósolni, ezért egyelre szerény versenytársai csak a különböz kemikáliáknak (Harman és Björkman, 1998; Hjeljord és Tronsmo, 1988). A mikoparazitizmus folyamatának molekuláris szint megismerése mindenképpen elsegíti a Trichoderma törzsek eredményesebb és megbízhatóbb felhasználását a biológiai védekezésben. A mikoparazita Trichoderma fajok a fitopatogén gombákat többlépcss folyamat során pusztítják el, amiben sejtfalbontó enzimek mellett a termelt antibiotikumok – köztük a peptaibolok – is szerepet játszanak (Lorito és   233mtsai, 1996). Feltételezések szerint a sejtfalbontó enzimek, pl. a kitinázok csökkentik a parazitált gomba sejtfalának merevségét (rigiditását), míg a peptaibol antibiotikumok gátolják a membránhoz kötött enzimeket. Ezek közé az enzimek közé tartoznak a sejtfal-komponensek szintetázai, így a parazitált gomba javító („repair”) enzimei nem képesek ellensúlyozni a sejtfalbontó enzimek hatását (Kubicek és mtsai, 2001). A peptaibolok olyan gombák által termelt lineáris polipeptidek, melyek 7-20 aminosavból állnak, és közös jellemzjük, hogy (i) viszonylag nagy arányban található bennük egy „abnormális” aminósav, az α-amino izobutánsav, (ii) N-terminális részükön alkil-csoport (általában acetil), (iii) C-terminális részükön amino-alkohol (pl. fenilalaninol vagy leucinol) található (Rebuffat és mtsai, 1999). A peptid típusú antibiotikumok közé tartozó peptaibolokat kizárólag gombák, köztük a Trichoderma, Hypocrea, Gliocladium, Acremonium nem fajai termelik (Degencolb és mtsai, 2003). A peptaibolok a membránokat permeabilizálják. A peptaibolok a nem riboszómán szintetizálódó polipeptidek közé tartoznak. T. virens-bl a közelmúltban klónoztak egy peptaibol szintáz enzimet kódoló szekvenciát (tex1). A tex1 62,8 kb hosszúságú, intron nélküli „open reading frame”, amely 18 peptid szintáz modulból, valamint egy-egy, az N- és C-terminális részen található, fehérjét módosító doménbl áll (Wiest és mtsai, 2002).  Tervezett munkánk célja megvizsgálni egy könnyen transzformálható, régóta tanulmányozott, peptaibolt termel mikoparazita Trichoderma törzs, a T. reesei (Hypocrea jecorina) peptaibol termelését befolyásoló tényezket, és felderíteni a bioszintézis molekuláris szint szabályozását. Mivel a biológiai védekezésben használt fajok legtöbbje nehezen transzformálható (C.P. Kubicek személyes közlése), a vizsgálatokhoz egy könnyen transzformálható, hosszú ideje tanulmányozott és peptaibolt is termel (http://www.cryst.bbk.ac.uk/peptaibol), korábban már általunk is vizsgált (Seiboth és mtsai, 2002) Trichoderma fajt, a T. reesei (Hypocrea jecorina) pyr4 – (uridin prototróf) TU 6 törzsét használjuk majd, amely szintén igen aktív a növénypatogén (pl. Pythium) fajokkal, szemben (C.P. Kubicek, nem publikált eredmény).  Eredmények  A génexpresszió Northern analízissel történ vizsgálatát az intront nem tartalmazó tex1 gén szokatlan nagysága miatt (csaknem 63 kb) elvetettük. A további vizsgálatokhoz egy riporterrendszert hoztunk létre, amelyben a peptaibol szintetázt kódoló tex1 promóter szekvenciája után egy riportergént, nevezetesen az Aspergillus niger glükóz oxidáz génjét (goxA) ültettünk be. A Trichoderma nemzetségbe tartozó vad típusú fajok közös   234 jellemvonása, hogy nem rendelkeznek glükóz oxidáz aktivitással (Mach és mtsai, 1999).  Els lépésként megkerestük a T. virens tex1 génjéhez nagyon hasonló, peptaibol szintetázt kódoló szekvenciát a T. reesei genomjában. Ezt követen a kódoló résztl 5’ irányban található 900 bp-nyi, a promóter régiót tartalmazó szakaszt PCR-el felszapotítottuk (1. ábra).           1  2 1 000 bp ptex1 - 900 bp 1. ábra: a ptex1 amplifikációja PCR-el 50 (1) és 55 (2) OC-os  anellációs hmérsékleten   235A pTES1 plazmid létrehozásához a tex1 promóter régiót tartalamzó fragmentumot (ptex1) a megfelel restrikciós hasító-helyek segítségével „kicseréltük” a pSJ2 plazmid pnag1 szakaszával (2. ábra).     2. ábra: A pTES1 plazmid létrehozásának vázlata  A T. reesei protoplasztokat kotranszformáltuk a tex1-promoter:goxA fúziót tartalmazó pTES1 plazmiddal és a pyr4 génnel PEG 6000 jelenlétében. Az így létrejött uridin auxotróf transzformánsok további szelelektálásával kiválasztottuk a megfelel tex1-promoter:goxA fúziót is tartalmazó T. reesei törzset. A transzformáns segítségével a továbbiakban vizsgálni fogjuk a peptaibol-termelést befolyásoló körülményeket. Célunk a maximális peptaibol-termeléshez szükséges paraméterek meghatározása, melyek segítséget nyújthatnak hatékonyabb Trichoderma biopreparátumok elállításához, illetve az eredményes biológiai védekezéshez szükséges körülmények kialakításához.  Karaffa Erzsébet (szül.: Sándor Erzsébet) az MTA Bólyai János Kutatói Ösztöndíjasa.  HindIII gox A pSJ3 5 647 bp XbaI XhoI pnag I Ampr 830 bp HindIII pTES1 5 517 bp XbaI XhoI 900 bp Ampr ptex I gox A    236 Irodalom  Degencolb, T,. Berg, A., Gams, W., Schlegel, B., and Grafe, U. (2003): The occurrence of peptaibols and structurally related peptaibotics in fungi and their mass spectrometric identification via fragment ions. J Peptide Sci. 9: 666-678. Harman, G.E. and Björkman, T. (1988): Potential and existing use of Trichoderma and Gliocladium for plant disease control and plant growth enhancement. In: Harman G.E., Kubicek C.P. (Eds.). Trichoderma and Gliocladium Vol. 2. Enzymes, Biological Control and Applications, 2. Taylor and Francis Ltd, London, UK pp. 229-266. Hjeljord, L. and Tronsmo, A. (1988): Trichoderma and Gliocladium in biological control: an overview. In: Harman G.E., Kubicek C.P. (Eds.). Trichoderma and Gliocladium Vol. 2. Enzymes, Biological Control and Applications, 2. Taylor and Francis Ltd, London, UK, pp. 131-152. Kubicek, C. P., Mach, R, L., Peterbauer, C, K., and Lorito, M. (2001): Trichoderma: from genes to biocontrol. J Pant Pathol 83:11-23. Lorito, M., Farkas, V., Rebuffat, S., Bodo, B., and Kubicek, C.P. (1996): Cell-wall synthesis is a major target of mycoparasitic antagonism by Trichoderma harzianum. J. Bacteriol. 178: 6382-6385. Mach, R.L., Peterbauer, C.K., Payer, K., Jaksits, S., Woo, S.L., Zeilinger, S., Kulling, C., M., and Kubicek, C.P. (1999): Expression of two major chitinase genes of Trichoderma atroviridae (T. harzianum P1) is triggered by different regulatory signals. Appl. Environ. Microbiol. 65: 1858-1863. Seiboth, B., Karaffa, L., Sándor, E., and Kubicek, C.P. (2002): The Hypocrea jecorina gal10 (UDP-glucose 4-epimerase-encoding) gene differs from yeast homologues in sequence, genomic organization and expression. Gene 295: 143-149. Wiest, A., Grzegorski, D., Xu, B.W., Goulard, C., Rebuffat, S., Ebbole, D.J., Bodo, B., Kenerley, C. (2002): Identification of peptaibols from Trichoderma virens and cloning of peptaibol synthetase. J. Biol. Chem. 277: 20862-20868.   237A REPORTER SYSTEM FOR PEPTAIBOL SYNTHETASE GENE EXPRESSION ANALYSIS IN TRICHODERMA REESEI  E. Sándor1, B. Seiboth2 , L. Karaffa3, E. Fekete3, L. Irinyi1, G.J. Kövics1 and C.P. Kubicek2 1Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, University of Debrecen, Hungary 2TU Vienna, Institute of Chemical Engineering, Division Applied Biochemistry and Gene Technology, Area Molecular Biotechnology, Vienna, Austria 3Department of Microbiology and Biotechnology, Faculty of Sciences, University of Debrecen, Hungary  Because of the potential importance of peptaibols in the biological control of plant diseases a transgenic T. reesei strain carrying a tex1-promoter:goxA fusion plasmid was constructed for further studies. The peptaibol synthetase gene (which is highly similar to T. virens tex1) was identified in the genome sequence of T. reesei. A 900 bp 5’ upstream noncoding fragment, presumed to include the promoter region of tex1 was cloned into the pSJ3 plasmid (which contains the Aspergillus niger goxA gene encoding glucose oxidase). Finally, we transformed T. reesei with the tex1-promoter:goxA fusion containing pSJ3 plasmid. 

Riporter rendszer létrehozása a Trichoderma reesei peptaibol szintetáz expressziójának analíziséhez

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Repository of the Academy's Library