科学研究費助成事業 研究成果報告書：若手研究(B)2016-2017課題番号 : 16K1900

Emi HASEGAWA

長谷川 恵美

Tsukuba Repository

中枢概日時計のニューロンタイプ特異的な神経生理
学的解析
著者 長谷川 恵美
発行年 2018
URL http://hdl.handle.net/2241/00158967
筑波大学・国際統合睡眠医科学研究機構・助教
科学研究費助成事業　　研究成果報告書
様　式　Ｃ－１９、Ｆ－１９－１、Ｚ－１９ （共通）
機関番号：
研究種目：
課題番号：
研究課題名（和文）
研究代表者
研究課題名（英文）
交付決定額（研究期間全体）：（直接経費）
１２１０２
若手研究(B)
2017～2016
中枢概日時計のニューロンタイプ特異的な神経生理学的解析
The neurophysiological analysis of neuronal type selective in the circadian 
clock
４０７６５９５５研究者番号：
長谷川　恵美（HASEGAWA, Emi）
研究期間：
１６Ｋ１９００５
平成 年 月 日現在３０   ６ １３
円     3,100,000
研究成果の概要（和文）：正常マウスとニューロンタイプ特異的変異マウスを用いて、中枢概日時計・視交叉上
核（SCN）の脳スライスにおけるAVP（arginine vasopressin）産生ニューロン、VIP（vasoactive intestinal 
peptide）産生ニューロンの神経活動や電気生理学的特性およびその日内変動を明らかにすることを目的として
研究を行ってきた。本研究課題にて、SCN内の神経活動の日内変動にGABA受容体が大きく関与しているというこ
とを確認できた。また、GABA受容体の応答性に対するAVP産生ニューロン、VIP産生ニューロンの神経活動の変化
は、それぞれ異なっており大変興味深い結果を得られた。
研究成果の概要（英文）：We have researched to clarify neuronal activity and electrophysiological 
characteristics, diurnal variation of AVP (arginine vasopressin) neurons, VIP (vasoactive intestinal
 peptide) neurons in the circadian clock / suprachiasmatic nucleus (SCN) by using the brain slice of
 normal mouse and neuron type specific mutant mouse. In this research project, we found that the 
GABA receptor is involved in the diurnal variation of neural activity in SCN. In addition, the 
change in neuronal activity by the responsiveness of GABA receptor was different depending on each 
neuron.
研究分野：神経科学
キーワード： 中枢概日時計　視交叉上核（SCN）　電気生理学的特性　GABA受容体
  １版
様 式 Ｃ－１９、Ｆ－１９－１、Ｚ－１９、ＣＫ－１９（共通） 
１．研究開始当初の背景 
 
 我々は、体内時計のリズムを持っているた
め、乱れると様々な疾患・健康障害が発症す
るリスクが高まることが知られている。しか
しながら、中枢概日時計の神経メカニズムの
詳細は、ほとんど未解明のままである。本研
究課題にて、この神経メカニズムを解明でき
れば、生活習慣の乱れによって生じる健康障
害に対する画期的な治療法や新薬の開発の
提案につながるのではないかと考えた。 
 概日リズム中枢として知られている視床
下部・視交叉上核（SCN）は、強固で安定し
た概日リズムを発振している。SCNの各細胞
内で概日リズムを刻む時計遺伝子を中心と
した分子メカニズムについては、ほぼ解明さ
れている。しかしながら、多数・多様な種類
のニューロンから構成されているSCN内にお
けるニューロンネットワークの作動メカニ
ズムは未解明である。SCNの一部は特定の神
経ペプチドを発現しているが、ほぼ全てのニ
ューロンは GABA作動性である。背内側に分
布するAVP (arginine vasopressin)産生ニュ
ーロンと腹側部に分布する VIP (vasoactive 
intestinal peptide)産生ニューロンがあり、
SCN内にて主要なニューロンタイプの 2つで
ある。VIPは、SCNニューロン間の同調に重
要な因子であることが多く報告されている
が、その作用機序の詳細は明らかではない。
AVPに関しては、VIPから直接の入力を受け、
そのシグナルをSCNから出力するために重要
な役割を担っていると考えられていた。しか
しながら、これまでに申請者らはAVPニュー
ロンがSCNの概日リズム発振に重要な役割を
果たすことを明らかにした。そこで、本研究
課題にて、SCN・AVPニューロン、VIPニュー
ロンの神経活動や電気生理学的特性とその
日内変動を、スライスおよびin vivoでのマ
ルチユニット・シングルユニット記録を行う
ことで、SCN内における作用機序の解明に試
みた。さらに、これまでに申請者らが開発し
てきた遺伝子組換えマウスリソースを最大
限活用することで、SCN内におけるニューロ
ンタイプ特異的に測定・解析することにも挑
戦した。 
 すでに、パッチクランプ法によるスライス
での正常マウスのAVPニューロンのホールセ
ル記録は開始しており、AVPニューロンは静
止膜電位の異なる以下の3グルーブに分類で
きるという大変興味深い予備データを得て
いた。①Na+電流とCa2+電流の混合したスパイ
クを発生するグループ（Class1）、②やや脱
分極しており、主に Ca2+スパイクを発生する
グループ（Class2）、③極度に脱分極してお
り、低振幅の膜電位変動のみを示すグループ
（Class3）。すなわち、AVPニューロンには異
なる神経活動パターンを持っている細胞体
が共存していることが示唆される。しかしな
がら、この現象の仕組みは解明されていない
ため、電気生理学的特性の差異が生じる分子
メカニズムの追求を試みた。 
 
 
２．研究の目的 
 
 中枢概日時計・視交叉上核 (SCN)ニューロ
ンネットワークの作動メカニズムを理解す
ることを目的とした。さらに、概日リズム異
常をもつニューロンタイプ特異的変異マウ
スを用いて、同様の解析を行うことで、細
胞・神経回路レベルの異常と行動レベルの異
常を結びつけることにも挑戦した。本研究課
題を進め、SCNのニューロンタイプ別の役割
を見出すことで、概日リズム障害の病態生理
の新たな知見や、特定の標的分子を狙った新
薬の開発の提案へつなげることを目指した。 
 
 
３．研究の方法 
 
 SCNスライスを作成し、AVPニューロンと
VIPニューロンの神経活動や電気生理学的特
性の日内変動を測定・解析した。さらに、正
常マウスとニューロンタイプ特異的変異マ
ウスを比較することで、ニューロンネットワ
ークの作動メカニズムの解明を試みた。 
 AVPニューロンのみ赤色蛍光でラベルされ
た脳スライスを作成するために、AVPニュー
ロン特異的 Creドライバーマウス（AVP-Cre
マウス）と、Cre依存的に赤色蛍光タンパク
質 tdTomatoを発現するレポーターマウス
（Ai14マウス、Jackson Laboratory）を交配
させた。昼間と夜間における神経活動を比較
するために、様々なパッチクランプ法（セル
アタッチ法やホールセル法、グラミシジン穿
孔パッチ法）を使い分けて解析を行った。ま
た、ニューロンタイプ特異的変異マウスとし
て、Avp-Bmal1-/-マウス（AVPニューロンのみ
で細胞時計を破壊）やAvp-Vgat-/-マウス（AVP
ニューロンのみで GABAのシナプス小胞放出
ができない）を用いた。これらのマウスを用
いた先行研究にて、すでにAVPニューロンが
SCNの概日リズム発振に極めて重要であるこ
とを見出している。そのため、これらのニュ
ーロンタイプ特異的変異マウスを用いて電
気生理学的特性と概日リズム行動解析を比
較することで、細胞・ネットワークレベルの
どのような異常が行動レベルの異常を生じ
るのか、明らかにしようとした。 
 VIPニューロンに関しても、同様の手法を
用いて実験を行った。 
 
 
４．研究成果 
 
① SCNスライスにおけるニューロンタイプ
別の電気生理学的特性の解析 
 正常マウスにおける AVPニューロンと VIP
ニューロンの神経活動を様々な時刻にて記
録した。SCNスライスを昼間、夜間、真夜中
でそれぞれ作製することで、日内変動をニュ
ーロンタイプ別に明らかにすることを試み
た。発火頻度や静止膜電位、膜抵抗、各種イ
オン電流に特に注目した。 
 発火頻度と静止膜電位においては、AVPニ
ューロンもVIPニューロンも日内変動の変化
を観察することができた。暗期（Night）に
比べ、明期（Day）の神経活動が活発であっ
た。現在は、より詳細な解析を行うために、
多様な時刻帯でのSCNスライスの作製を行い、
記録を行っている。その他の電気生理学的特
性においては、日内変動の変化を観察するこ
とはできなかった。 
 ホールセル記録により、AVPニューロンに
は静止膜電位が異なる3グループが存在する
ことが明らかになっていた。そのため、各
Classにおいて関与しているイオンメカニズ
ムを同定するため、様々なチャネルブロッカ
ー（TTX：Na+チャネル特異的ブロッカー、
CNQX：非 NMDA型グルタミン酸受容体アンタ
ゴ二スト、D-AP5：NMDA型グルタミン酸受容
体アンタゴ二スト、CdCl2：非特異的カルシウ
ムチャネルブロッカー、GABAzine：GABAA受
容体アンタゴニスト）の投与実験を行った。
Class1は TTXと CdCl2の両方を、Class2は
CdCl2のみの投与にて発火頻度を抑制するこ
とができた。すなわち、NaスパイクとCaス
パイクがAVPニューロンの神経発火の主成分
であることが分かった。また、SCN内のほぼ
全てのニューロンは GABA作動性であること
から、GABAA受容体の作動薬である Muscimol
の投与実験も行った。全Classにおいて、静
止膜電位が下がる（過分極）という予想外の
結果を得た。しかしながら、ホールセル記録
よる細胞内の環境変化が、このような結果を
見出した可能性があった。そこで、細胞内Cl-
濃度を正常に保った状態にて記録を行うこ
とができるグラミシジン穿孔パッチ法を用
いることで、この問題を解決した。グラミシ
ジン穿孔パッチ法を用いて同様の実験を行
ったが、得られた結果は同じであった。AVP
ニューロンの GABA応答性は、過分極である
という結果が明らかになった。現在は、GABA
平衡電位の測定・解析を行っている。 
 同様にして、VIPニューロンの検討を行っ
たところ、TTXの投与のみにて、VIPニュー
ロンの発火頻度を抑制することができた。ま
た、Muscimolの投与実験においては、静止膜
電位が上がる（脱分極）という結果を得た。
グラミシジン穿孔パッチ法を用いても、同様
の結果を得た。 
 これらの結果より、AVPニューロンと VIP
ニューロンでは、異なるイオンメカニズムが
働いている可能性が高いことが示唆された。
また、SCN内におけるニューロンネットワー
クの構築の解明には、ニューロンタイプ別の
解析が重要であることも分かった。 
 
② ニューロンタイプ特異的変異マウスを用
いたSCNスライスにおけるニューロンタイプ
別の電気生理学的特性の解析 
 概日リズム行動解析にて、それぞれ異なる
異常が確認できた AVP-Bmal-/-、AVP-Vgat-/-、
VIP-Bmal-/-、VIP-Vgat-/-マウスを用いた。実
験手法としては、①と同様のプロトコールを
用いて、正常マウスにて得られた結果と比較
検討を行った。 
 全てのマウスにおいて、正常マウスとは異
なる実験結果を得た。また、GABAに対する応
答性も異なっていた。すなわち、これらのニ
ューロンタイプ特異的変異マウスでは、電気
生理学的特性においても異常が生じている
ことが示唆される。それぞれのマウスにおい
て、異なる異常を確認できているため、どの
細胞の分子メカニズムの異常が、どの行動レ
ベルの異常を生じているのかを解明するこ
とができる可能性がある。現在、より詳細な
解析を進めている。 
 AVPニューロンや VIPニューロンには、
Bmal1やVgat以外にも注目すべき分子がある
ため、それらについても検討していく必要が
あると考えた。現在、それらのマウスについ
ても準備中である。また、概日リズムの乱れ
は、AVPニューロンと VIPニューロンの両方
を標的にした方が、より顕著な概日リズム行
動異常を観察できる。したがって、今後は両
ニューロンにて特定の分子を標的にしたマ
ウスを作製し、電気生理学的特性の測定も必
要になってくると考える。これらを一つずつ
解明していくことで、SCN内で構築されてい
るニューロンネットワークのメカニズムを
解明でき、その破綻にて生じる疾患・健康障
害の病態生理の解明に役立つ可能性がある
と考える。 
 
「引用文献」 
なし 
 
 
５．主な発表論文等 
（研究代表者、研究分担者及び連携研究者に
は下線） 
 
〔雑誌論文〕（計 0件） 
 
〔学会発表〕（計 0件） 
 
〔図書〕（計 0件） 
 
〔産業財産権〕 
 
○出願状況（計 0件） 
 
名称： 
発明者： 
権利者： 
種類： 
番号： 
出願年月日： 
国内外の別：  
 
○取得状況（計 0件） 
 
名称： 
発明者： 
権利者： 
種類： 
番号： 
取得年月日： 
国内外の別：  
 
〔その他〕 
ホームページ等 
 
 
６．研究組織 
 
(1)研究代表者 
  長谷川 恵美（ HASEGAWA Emi  ） 
 筑波大学・国際統合睡眠医科学研究機
構・助教 
 研究者番号：  40765955 
 
 
 
 


中枢概日時計のニューロンタイプ特異的な神経生理学的解析

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中枢概日時計のニューロンタイプ特異的な神経生理学的解析

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