Involvement of the yeast PDK1 orthologs Pkh1-3 in nutrient-induced signaling.

Abstract

Nutriënten zijn belangrijke regulatoren van groei. Wanneer een essentiee l nutriënt, zoals een koolstof- , stikstof- of fosfaatbron niet meer aan wezig is in hun omgeving, zullen gistcellen stoppen met groeien en overg aan in een soort van slapende toestand, stationaire fase genoemd. In dez e toestand kunnen cellen periodes zonder voedsel overleven, onder andere door hun verhoogde stresstolerantie. Toevoegen van het ontbrekende nutr iënt, in de aanwezigheid van een fermenteerbare koolstofbron, activeert de Fermenteerbaar Groei Medium (FGM) signaalweg. Dit zorgt ervoor dat de cellen de stationaire fase eigenschappen verliezen en opnieuw beginnen te groeien. Verschillende eiwitten in de plasma membraan van gist werden geïdentific eerd die niet alleen de toegevoegde nutriënten in de cel transporteren, maar tegelijkertijd ook dienst doen als nutriëntsensor en zo de FGM sign aalweg activeren. Helaas zijn er momenteel weinig andere componenten van deze signaalweg gekend. Behalve proteïne kinase < U&gt;A (PKA) is het kinase Sch9 (het gist homoloog van de zoogdier eiwitten PKB en S6K) het enige andere eiwit waarvan we weten da t het nodig is voor activatie van de FGM signaalweg door een stikstofbro n. In deze studie hebben we onderzocht wat het belang is van de gist eiwitt en Pkh1-3 (kinasen die sterk gelijken op het zoogdier eiwit PDK1) voor d e juiste respons op het toevoegen van nutriënten. Zowel de katalytische subeenheden van PKA (de eiwitten Tpk1-3) als het Sch9 kinase hebben een mogelijke PDK1 fosforylatiesite, wat erop duidt dat deze eiwitten mogeli jk substraten zijn van Pkh1-3. Om te achterhalen of Pkh1-3 ook effectief een rol spelen in FGM signalering, bestudeerden we eerst hun belang in de activatie van het enzyme trehalase, één van de doelwitten van de FGM signaalweg. In cellen zonder Pkh1-3 is de trehalase activatie door zowel glucose als door een stikstofbron sterk verlaagd. De katalytische subeenheden van PKA zijn nodig voor zowel stik stof- als glucose-geïnduceerde activatie van de FGM signaalweg. Pkh1 fos foryleert Tpk1 inderdaad in vitro, maar deze fosforylatie is in vivo&amp;nbs p;niet afhankelijk van Pkh1-3. Bovendien blijkt dat factoren waarvan gew eten is dat ze PKA activiteit verhogen, zoals bvb. toevoegen van glucose aan glucose-gedepriveerde cellen, niet zorgen voor een toename in PDK1 site fosforylatie van Tpk1. Hoewel we voorlopig niet weten welk kinase d eze site in Tpk1 fosforyleert, tonen onze resultaten wel dat deze fosfor ylatie zeer belangrijk is voor de activiteit van PKA. Bovendien is fosfo rylatie ook nodig voor binding van de regulatorische subeenheid. Dit lig t in de lijn van wat gekend is over het belang van deze site in zoogdier PKA. We tonen hier voor de eerste keer dat Pkh1-3 nodig zijn voor stikstofsig nalering in gist, en dat zij Sch9 fosforyleren. Bovendien verdwijnt deze fosforylatie als er geen stikstof aanwezig is, en keert ze terug wannee r er terug stikstof (en alle andere componenten die nodig zijn voor groe i) aanwezig is. Op deze manier lijkt de fosforylatie van Sch9 sterk same n te hangen met de groei van de cel. Onze gegevens wijzen dus op een nie uwe functie van de gist Pkh eiwitten, naast hun reeds gekende rol in cel integriteitssignalering. Andere onderzoekers toonden recent aan dat ook het TORC1 eiwitcomplex Sc h9 fosforyleert op een stikstofafhankelijke manier. Samen met onze resul taten, duidt dit op een centrale rol voor Sch9 in stikstofsignalering in gist.status: publishe