Functional characterisation of the Rhizobium etli type III secretion system

Abstract

Rhizobium etli is een Gram-negatieve bodembacterie die een stikstoffixerende symbiose kan aangaan met Phaseolus vulgaris L., de gewone boonplant. Een uitgebreide signaal­uitwisseling leidt tot de infectie van de wortels en de vorming van gespecialiseerde plantenorganen, de wortelnodules. Bacteriële signalen die de specificiteit van de interactie bepalen zijn onder meer Nod factoren, oppervlaktepolysachariden en gesecreteerde proteïnen. Het belang van gespecialiseerde proteïnesecretiesystemen die zogeheten effectoren rechtstreeks in het cytosol van gastheercellen kunnen transloceren, wordt steeds duidelijker. Een dergelijk secretiemechanisme, dat intensief bestudeerd wordt, is het type III secretiesysteem (T3SS). Deze macromoleculaire machine is essentieel voor de virulentie van vele pathogenen van planten en dieren. Een tiental jaar geleden werd aangetoond dat T3SS ook een rol kunnen spelen in de symbiose tussen rhizobia en vlinderbloemige planten. Analyse van de in 2003 gepubliceerde DNA-sequentie van het symbiotische plasmide van R. etli duidde op de aanwezigheid van een T3SS. Dit vormde de aanleiding voor nader onderzoek van de rol die het R. etli T3SS speelt in de symbiotische interactie met P. vulgaris. Een gedetailleerde in silico analyse van de R. etli T3SS-regio leidde tot de identificatie van alle zogenaamde Rhizobium geconserveerde (rhc), structurele genen, op één na. Er werd een genomische kernregio afgebakend die in verscheidene R. etli stammen van diverse geografische origine geconserveerd is. Drie genen die coderen voor kandidaat-helperproteïnen werden gevonden: hrpW, hrpK1 en hrpK2. De laatste twee hebben kenmerken van translocatorproteïnen en zouden dus kunnen bijdragen tot de translocatie van effectorproteïnen naar het gastheercelcytosol. Er werden ook kenmerken van de R. etli T3SS-regio afgeleid die merkelijk verschillen van de overeenkomstige loci in andere rhizobia. Zo ontbreken een homoloog voor een geconserveerd buitenmembraansecretine en verscheidene regulatorische elementen. Dit wijst op aanzienlijke divergentie binnen rhizobiële T3SS. Een fylogenetische analyse bevestigde deze stelling.De symbiotische rol van het R. etli T3SS werd geanalyseerd door het symbiotisch fenotype van P. vulgaris te bepalen na inoculatie met ofwel de wildtype stam, ofwel een rhcN mutant. Door het screenen van genetisch diverse P. vulgaris variëteiten kon een gastheer­specifiek effect op nodulatie vastgesteld worden bij een beperkt aantal boonvariëteiten. Enkele wilde en onkruidachtige variëteiten vormden beduidend meer pseudonodules na inoculatie met een rhcN mutant, terwijl sommige gecultiveerde variëteiten omgekeerd reageerden. Expressie van de R. etli T3SS-genen werd bestudeerd op transcriptioneel niveau door gebruik te maken van een promotorloos gusA gen als reporter. Ondanks het testen van een grote verscheidenheid aan experimentele condities en stimuli kon geen duidelijke inductie waargenomen worden. Secretie werd nagegaan op translationeel niveau door een proteoomanalyse van eiwit­fracties geïsoleerd uit cultuursupernatans. Er konden geen verschillen waargenomen worden tussen de wildtype stam en de rhcN mutant.Ten slotte werd R. etli HrpW onderzocht. Dit proteïne is een mogelijk substraat voor het T3SS en werd tot dusver uitsluitend in plantpathogene bacteriën aangetroffen. Het eiwit werd tot overexpressie gebracht, opgezuiverd en biochemisch gekarakteriseerd. Er werd enzymatische activiteit aangetoond voor het carboxyterminaal gelegen pectaat­lyasedomein. Dit is, voor zover wij weten, de eerste keer voor een HrpW-achtig proteïne.I.The role of rhizobial protein secretion in the Rhizobium-legume symbiosis II.In silico analysis of the Rhizobium etli type III secretion system region III.The role of the Rhizobium etli type III secretion system in symbiosis with Phaseolus vulgaris L. IV.Expression analysis of the Rhizobium etli type III secretion system V.In search of substrates for the Rhizobium etli type III secretion system VI.Characterisation of the Rhizobium etli candidate T3SS substrate HrpW VII.General conclusions and perspectivesstatus: publishe