Mechanism and role of COX-2 up-regulation by photodynamic therapy.

Abstract

Fotodynamische therapie (PDT) is een erkende, minimaal invasieve therape utische aanpak voor de behandeling van verschillende tumoren en sommige goedaardige gezwellen. PDT is gebaseerd op het gecombineerd gebrui k van een licht absorberende stof (fotosensibilisator), die preferentiee l accumuleert in maligne tumoraal weefsel, en de bestraling met zichtbaa r licht van een golflengte die overeenkomt met het absorptiespectrum van de fotosensibilisator. Dit belichtingsproces leidt in de aanwezig heid van moleculaire zuurstof tot de ontwikkeling van reactieve zuurstof moleculen wat tenslotte resulteert in celdood. Bijgevolg staat PD T een tweezijdige specificiteit toe daar de simultane aanwezigheid van z owel de fotosensibilisator als licht noodzakelijk is. Hypericine, een polycyclische aromatische verbinding die behoort tot de chemische klasse van de fenantroperyleenchinonen, is een natuurlijk voor komende fotosensibilisator aanwezig in Hypericum perforatum, beter gekend als St.-Janskruid. Zijn fotochemische en -fysische eigensc happen samen met het feit dat hypericine in het donker noch toxisch, noc h genotoxisch is, maken van deze fotosensibilisator een beloftevol midde l in PDT. Voorafgaande studies met humane kankercellen hebben reed s aangetoond dat PDT met hypericine apoptose of necrose induceert, afhan kelijk van de gebruikte concentratie en licht dosis. In een experi menteel diermodel leidde hypericine PDT van een blaaskanker cel tot een dramatische vermindering van het groeipotentieel van de tumorcellen, maa r heropleving van de tumor kan optreden. Daarom werd deze studie o pgezet met als doel om op moleculair niveau de mogelijke targets op te s poren die deze adaptieve respons van de kankercel op hypericine PDT regu leren. In dit werk werd duidelijk aangetoond dat zowel hypericine als pyropheop horbide-a methyl ester (PPME) gebaseerde PDT van humane kankercellen, le idt tot een verhoogde expressie van het induceerbare cyclooxygenase-2 (C OX-2) enzym en een daarmee samengaande secretie van prostaglandine E2 (P GE2). De signaalwegen en het mechanisme die verantwoordelijk zijn voor deze COX-2 inductie blijken fotosensibilisator specifiek te zijn.&n bsp; Het uitdiepen van de signaalwegen legde bloot dat het p38 MAPK een belangrijke rol speelt in de door hypericine PDT geïnduceerde overexpres sie van COX-2. Het blokkeren van deze signaalweg met behulp van ee n farmacologische remmer van het p38 MAPK (PD169316), verhinderde de PDT geïnduceerde COX-2 expressie volledig, en dit effect kon worden omgekee rd door de overexpressie van een drugresistente mutant van het p38 MAPK. Bovendien vertoonde p38a MAPK knock-out MEFs een gebrekkige COX-2 inductie na hypericine PDT. Verdere ontleding van deze signaalweg toonde aan dat de COX-2 expressie in antwoord op hypericine PDT afhanke lijk is van de selectieve activering van het p38 MAPK substraat MAPK gea ctiveerd proteïnekinase-2 (MK2). Het mechanisme dat verantwoordeli jk is voor de PDT geïnduceerde COX-2 mRNA en proteïne niveaus heeft geen betrekking tot NF-kB activering. Meer nog, dit inductieproces is onafhankelijk van de transcriptionele activering van de cox-2 genp romoter. Uit de studie van de halfwaardetijd van het COX-2 mRNA bl ijkt dat het p38 MAPK zijn effect hoofdzakelijk uitoefent via de stabili sering van het COX-2 transcript. Bijgevolg duiden deze data op de betrokkenheid van een door p38 MAPK-MK2 tot stand gebrachte stabiliserin g van het COX-2 transcript na hypericine PDT. In tegenstelling, PP ME PDT induceert de transcriptionele activering van de cox-2 genpr omoter en deze activering kan worden verhinderd door het gebruik van een IKK antagonist (BAY117085). Bovendien waren Hela cellen, die de N F-kB super-repressor IkBa (S32-36A) tot expressie brengen, aangetast in hun PDT geïnduceerde COX-2 expressie, wat duidelijk het belang van de IK K-IkBa-NF-kB weg in deze PDT respons aantoont. In een tweede deel van deze studie hebben we de functionele rol van deze COX-2 regulatie bestudeerd in de PDT geïnduceerde cellulaire respons.&n bsp; We ontdekten dat vrij arachidonzuur (AA), dat na hypericine PDT vri jgesteld wordt uit de membraan fosfolipiden door PLA2 activiteit, zou ku nnen functioneren als een belangrijke regelaar in het bepalen van de cel dood/overlevingsbalans na PDT. Aan de ene kant functioneert AA als een dood boodschapper , en aan de andere kant draagt het bij tot de ac tivering van de p38 MAPK-COX-2 cascade. Dus, overexpressie van COX -2 fungeert als een intracellulaire gootsteen voor niet veresterd AA e n bevordert de productie van PGE2. Hoewel we konden aantonen dat h et blokkeren van de p38 MAPK activiteit de apoptotische respons na PDT v ersterkt, was dit niet het geval voor de inhibitie van COX-2 activiteit. Het is bijgevolg onwaarschijnlijk dat COX-2 de stroomafwaartse me diator voorstelt van de p38 MAPK signaalcascade die een negatieve invloe d heeft op de aanvang van het apoptotische proces in PDT beschadigde cel len. Hoe dan ook, een belangrijk rol kan toegeschreven worden voor de p38 MAPK-COX-2 cascade in het proces van neo-angiogenese, daar PDT g eïnduceerde PGE2 en VEGF secretie endotheelcel migratie veroorzaakt, een essentiële stap in angiogenese. Hoewel endotheelcel migratie in d ezelfde mate wordt verhinderd door de COX-2 remmer NS398, is de inhibiti e van de p38 MAPK signaalweg efficiënter in het blokkeren van VEGF synth ese. Samenvattend blijkt de inhibitie van de p38 MAPK signaalweg m eer belovend te zijn als een nieuwe behandelingsstrategie voor hypericin e PDT vergeleken met het gebruik van COX-2 remmers, daar het alle COX-2 afhankelijke fenotypes zou kunnen omvatten. Alles bij elkaar moedi gen deze resultaten aan tot verdere in vivo studies om het anti-an giogene en pro-apoptotische potentieel te bepalen van hypericine PDT van tumoren gecombineerd met de farmacologische inhibitie van p38 MAPK.Chapter 1. General introduction 1. Photodynamic therapy 1.1. PDT in medicine: a historical perspective 1.2. Mechanism of action 1.3. Photosensitizers 2. Cell fate after photodynamic therapy 2.1. Brief introduction to apoptosis 2.2. Cell death pathways in PDT 2.3. Signaling pathways in PDT 3. Cyclooxygenase-2 3.1. Cyclooxygenase isozymes 3.2. Mechanisms of catalysis and inhibition 3.3. Regulation of expression 3.4. COX-2 in cancer and in response to drug therapy Chapter 2. Aims and outline of the study Chapter 3. Materilas and methods 1. Materials 2. Experimental procedures 2.1. Cell culture 2.2. Cell photosensitization 2.3. Preparation of cell extracts and Western blotting 2.4. Caspase assay 2.5. Immunoprecipitation and protein kinase assay 2.6. Asessment of cell viability 2.7. Cell death assay 2.8. Transient transfections 2.9. Luciferase reporter assay 2.10. Cell cycle analysis 2.11. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 2.12. (Ca²+ )cyt measurements with Indo-1 2.13. Arachidonic acid release 2.14. PGE2 and VEGF measurement 2.15. RT-PCR 2.16. RNA stability assay 2.17. Endothelial cell migration Chapter 4. Signaling pathways mediating the up-regulation of cyclooxygenase-2 in PDT-treated cancer cells 1. Introduction 2. Results 2.1. Hypericin-mediated PDT of cancer cells leads to up-regulation of COX-2 2.2. Cyclooxygenase-2 is up-regulated by the restricted activation of p38 MAPK 2.3. NF-κB is not involved in the up-regulation of COX-2 by hypericin-PDT 2.4. COX-2 mRNA is stabilized by p38 MAPK in hypericin-PDT treated cells 2.5. The mechanisms of COX-2 up-regulation by PDT are photosensitizer specific 2.6. The cox-2 gene is transcriptionally regulated upon PPME-PDT Chapter 5. On the role of p38 MAPK-COX-2 cascade in hypericin-based PDT 1. Introduction 2. Results 2.1. PDT induces rapid rise in (Ca²+)cyt and cPLA2 generated arachidonic acid release 2.2. PLA2-generated arachidonic acid contributes to apoptosis and to p38 MAPK activation following hypericin-PDT 2.3. p38α supports survival after PDT injury 2.4. The COX-2 antagonist NS398 does not significantly sensitize cells to PDT-induced apoptosis 2.5. Inhibition of p38 MAPK abolishes PGE2 and VEGF release 2.6. Targeted p38 MAPK inhibition suppresses tumor-associated endothelial cell migration Chapter 6. General discussion and perspectives 1. Signaling pathways mediating the up-regulation of cyclooxygenase-2 in PDT treated cells 2. On the role of p38 MAPK-COX-2 cescade in PDT Summary Samenvatting Referencesstatus: publishe