A reference sequence for Blumeria graminis f. sp. tritici (wheat powdery mildew) and its application for comparative and evolutionary genomics

Abstract

Powdery mildew is one of the most important cereal diseases. It is caused by fungi of the species Blumeria graminis, which have an obligate-biotrophic lifestyle and are specific for a single host plant species. The topic of this thesis is the molecular analysis of the genome sequence of Blumeria graminis forma specialis tritici (B.g. tritici), the powdery mildew pathogen of wheat, with regard to its biology as a plant pathogen. Powdery mildew of wheat and barley are caused by B.g. tritici and B.g. hordei, respectively. In a pilot study, a comparative analysis of two orthologous loci in the genomes of the two fungi revealed that the orthologous genes are well conserved and synthenic, whereas the intergenic regions are highly diverse and massively populated with transposable elements (TEs). A divergence time estimate based on the sequence alignments indicates that B.g. tritici and B.g. hordei have co-evolved with their hosts. The major part of this work reports on the reference sequence of B.g. tritici (isolate 96224) and its bioinformatic analysis. B.g. tritici was found to be large with a high content of repetititve DNA and TEs. To get an overview of the TE population in the B.g. tritici genome, we produced a repeat library that contains the 56 most abundant TEs. The library was also used to annotate TEs in the genome sequence. As was found in other biotrophic fungi, B.g. tritici lacks a number of genes which code for proteins that are involved in the degradation of cell wall components, carbohydrate transport, nitrate and sulfur metabolism or the production of secondary metabolites. Based on comparative analysis with B.g. hordei, we identified about 600 candidate effector genes that could play a role during the infection process or the determination of host specificity. In addition to the Swiss isolate 96224, we re-sequenced the genomes of three wheat powdery mildew isolates from UK, Israel and Switzerland. Compared to the reference (isolate 96224), the three re-sequenced isolates differ in the absence of certain genes, most of them are effector candidates. Apparently, there is a selective pressure for loosing these genes which makes them candidates for determinants of race specific interactions. Single nucleotide polymorphisms present in the genome of the three isolates compared to the reference were found to be unevenly distributed, which leads to a mosaic structure of these genomes consists of younger and more ancient regions. These highly diverse haplogroups have already existed prior to the domestication of wheat. We hypothesize that the occurrence of bread wheat as a new host for B.g. tritici did not lead to a dramatic loss of genetic diversity in the genome, and that the highly diverse haplotype pool provides a large genetic potential for pathogen variation facilitating its ready adaptation to new host species. Mehltau ist weltweit eine der verheerendsten Getreidekrankheiten. Verursacht wird sie von Pilzen der Art Blumeria graminis, welche eine obligat-biotrophe Lebensweise haben und wirtsspezifisch, also spezialisiert auf eine Pflanzenart sind. Diese Arbeit befasst sich mit der molekularen Analyse der Genomsequenz von Blumeria graminis forma specialis tritici (B.g. tritici), dem Verursacher von Mehltau bei Weizen, hinsichtlich seiner Biologie als Getreidepathogen. Mehltau bei Weizen und Gerste wird von zwei unterschiedlichen Pilzen verursacht, welche jeweils spezifisch für ihre Wirtspflanze sind. Ein Sequenzvergleich zweier orthologer Loci aus den Genomen der beiden Pilze hat gezeigt, dass die orthologen Gene synthenisch und stark konserviert sind, während sich die intergenen Regionen grundlegend unterscheiden und einen sehr hohen Anteil an Transposons enthalten. Der Sequenzvergleich ermöglichte ausserdem eine Schätzung des Zeitpunkts der Trennung der beiden Pathogene von ihrem letzten gemeinsamen Vorfahren, was auf eine Co-evolution der beiden Pathogene mit ihren jeweiligen Wirten hindeutet. Der Hauptteil der Arbeit widmet sich der vollständigen Sequenzierung des Weizenmehltau-Genoms (Isolat 96224) und seiner bioinformatischen Analyse. Mehltaupathogene haben, verglichen mit dem anderen Pilzen, ein relativ grosses Genom, welches reich bevölkert ist mit repetititven Elementen, sogenannten Transposons. Mit dem Ziel einen Überblick über die Transposonpopulation im Weizenmehltaugenom zu erhalten, haben wir eine Transposon-Datenbank mit den 56 häufigsten repetitiven Elemente, welche im Weizenmehltaugenom vorkommen, erstellt. Diese Datenbank wurde benützt um Transposons in der Genomsequenz zu annotieren. Wie schon bei anderen biotrophen Pilzen gefunden wurde, fehlen im B.g. tritici Genom bestimmte Gene, zum Beispiel solche, die für Proteine kodieren, die in den Abbau von Zellwandkomponenten, Kohlenhydrattransport, Nitrat- und Schwefelmetabolismus oder Produktion von Sekundärmetaboliten involvert sind. Mittels vergleichender Studien mit B.g. hordei konnten etwa 600 Gene identifiziert werden, welchen eine tragende Rolle während dem Infektionsprozess oder der Festlegung der Wirtspezifität zugeschrieben wird (sogenannte Effektoren). Zusätzlich zum Schweizer Isolat 96224 wurden noch drei weitere Mehltauisolate sequenziert, welche in Grossbritannien, Israel und der Schweiz gesammelt wurden. Im Vergleich zur Referenz, dem Isolat 96224, fehlen den drei zusätzlich sequenzierten Isolaten einzelne Gene, von denen fast alle Effektorkandidaten sind. Diese Gene, welche offensichtlich einer Selektion bezüglich deren Verlust unterliegen, könnten als entscheidende Faktoren der Rassenspezifität der Isolate wirken. Ausserdem unterscheiden sich die drei re-sequenzierten Isolate im Vergleich zur Referenz auch in einzelnen Basen, sogenannten SNPs (single nucleotide polymorphisms). Diese sind ungleich im Genom verteilt und führen zu einer Mosaikstruktur von "älteren" uns "jüngeren" Bereichen. Diese höchst verschiedenartigen Haplogruppen haben schon vor der Domestikation von Weizen existiert. Wir vermuten, dass die Enstehung von Brotweizen als neue Wirtpflanze nicht zu einer Reduktion der genetischen Vielfalt im B.g. tritici Genom geführt hat, und dass die hohe Vielfalt an Haplotypen ein grosses genetisches Potenzial für Pathogenvariablilität darstellt, welches die schnelle Anpassung an neue Wirtspflanzen begünstigt