科学研究費助成事業 研究成果報告書：挑戦的萌芽研究2016-2017課題番号 : 16K1471

Kazuto NAKADA

中田 和人

Tsukuba Repository

ミトコンドリアゲノム変異の病原性発揮における細
胞種特異的な感受・抑制機構の解明
著者 中田 和人
発行年 2018
URL http://hdl.handle.net/2241/00158920
筑波大学・生命環境系・教授
科学研究費助成事業　　研究成果報告書
様　式　Ｃ－１９、Ｆ－１９－１、Ｚ－１９ （共通）
機関番号：
研究種目：
課題番号：
研究課題名（和文）
研究代表者
研究課題名（英文）
交付決定額（研究期間全体）：（直接経費）
１２１０２
挑戦的萌芽研究
2017～2016
ミトコンドリアゲノム変異の病原性発揮における細胞種特異的な感受・抑制機構の解明
Studies on skeletal muscle fiber-type specific responses to pathogenic mtDNA
８０３２３２４４研究者番号：
中田　和人（NAKADA, Kazuto）
研究期間：
１６Ｋ１４７１９
平成 年 月 日現在３０   ６ １８
円     2,300,000
研究成果の概要（和文）：本研究では、骨格筋繊維におけるglucose transporter 4 （GULT4）の筋細胞膜直下
への移動と蓄積が病原性突然変異型ミトコンドリアDNA（mtDNA）の蓄積に対する抵抗性に重要な役割を果たして
いることを実験的に立証することに成功した。この結果は、GULT4を介したインスリンシグナルの増強が変異型
mtDNA分子種によって誘発される多様な病態の治療戦略になり得ることを示唆している。
研究成果の概要（英文）：To examine mechanisms for cell-type specific sensitivities to mutant 
mitochondrial DNA (mtDNA), we used model mice heteroplasmic for wild-type mtDNA and pathogenic mtDNA
 with a deletion (del-mtDNA). In skeletal muscles with a high loads of del-mtDNA, mitochondrial 
respiration defects observed in slow oxidative type 1 and fast oxido-glycolytic type 2A/2X fibers, 
but not in fast glycolytic type 2B fibers that the relocation of glucose transporter 4 (GULT4) to 
sarcolemma from cytoplasm was accelerated. Chemical deconditioning of the relocation of GLUT4 
induced mitochondrial respiration defects in 2B fiber and creation of ragged-red fibers in fast 
muscle tissues. Our findings indicated that relocation of GLUT4 in skeletal muscle fibers is 
necessary for tolerance to accumulation of del-mtDNA and also suggested that controls of insulin 
signaling via GULT4 would be a target for recovering mitochondrial respiration defects of cells with
 oxidative property in mtDNA-mediated disorders.
研究分野：細胞生物学
キーワード： ミトコンドリア　ミトコンドリアDNA　突然変異　骨格筋　インスリンシグナル　ミトコンドリア病　モ
デルマウス
  １版
様 式 Ｃ－１９、Ｆ－１９－１、Ｚ－１９、ＣＫ－１９（共通） 
１．研究開始当初の背景 
 ミトコンドリアには独自のゲノムである
ミトコンドリアDNA（mtDNA）が細胞あたり数
百から数千コピー存在し、エネルギー産生に
必要な 13種の機能タンパク質と、これらの
翻訳に必須な 22種の tRNAsと２種の rRNAs
をコードしている。このため、mtDNA分子に
生じた突然変異の病原性はミトコンドリア
のエネルギー産生（ミトコンドリア呼吸機
能）の低下に帰結される。しかし、突然変異
が生じた箇所や変異型mtDNAの含有率によっ
て病原性の程度が異なると考えられる。つま
り、複数の遺伝子を喪失する欠失型変異では
重症の、特定の tRNA遺伝子の点変異では中
症の、特定の構造遺伝子の点変異では軽症の
エネルギー低下を惹起すると想定される。事
実、我々の専攻研究において、変異箇所の異
なる３種の変異型mtDNA導入マウスを作出し、
このような変異型mtDNA分子種による病原性
の相違を報告してきた（Nat Genet, 2000; Hum 
Mol Gnet, 2006; Science 2009; PNAS, 2012; 
PNAS, 2013）。さらに、欠失型 mtDNAを導入
したマウスにおいて、臓器間における欠失型
mtDNAの局在の差異と経時的な蓄積動態の変
化の差異が少なくとも２種の病型の遷移的
な発症に重要な役割を果たすことを明らか
にしている（Genes Genomes Genetics, 2013）。
このように、変異型mtDNA分子種による多様
な病型誘導は、１）変異種による相違（第１
の病型形成原理）、２）変異型 mtDNA分子の
臓器間局在と動態の相違（第２の病型形成原
理）、という２つの階層によって説明するこ
とができる。 
 このような状況の中、我々は欠失型 mtDNA
を導入したマウスの骨格筋組織を用いた基
礎実験において、欠失型mtDNAの蓄積によっ
て誘導されるエネルギー産生異常が、遅筋で
は顕著であるが、速筋ではほとんど誘導され
ないこと、さらに、欠失型mtDNAの蓄積（ミ
トコンドリア機能異常の誘導）によって骨格
筋の線維型が速筋型から遅筋型に遷移（分化
転換）する、という興味深い生体現象を見出
した。この現象をもとに、変異型mtDNAの蓄
積に対する細胞種間の感受性の差異のよる
病型誘導・抑制機構の存在（第３の病型形成
原理）を発想するに至った。 
 
２．研究の目的 
 変異型ミトコンドリアゲノム（mtDNA）が
ミトコンドリア病、神経変性疾患、がん、糖
尿病、老化など、多様な病型に関与すること
が示唆されはじめたことを受け、ミトコンド
リア機能の破綻病理が大きな注目を集めて
いる。しかし、ミトコンドリア関連疾患の基
礎研究は変異型mtDNA分子種の病原性把握に
終始し、前述のような多様な病型の形成を担
うであろう「変異型mtDNAの蓄積に対する細
胞種間の感受性の差異」についてはその分子
機構はおろか、存在すら証明されていない。 
 本研究では、マウス個体において欠失型
mtDNAの病原性が骨格筋組織間（速筋と遅筋）
で明らかに異なるという現象の発見を発端
に、この差異を生み出す生体機構を解明する
ことを目的とした。 
 
３．研究の方法 
 本研究では、欠失型mtDNAの蓄積による病
原性として誘導されるエネルギー産生異常
は遅筋では顕著であるが、速筋ではほとんど
見られないという現象の原因として、１）解
糖系に依存する速筋は欠失型mtDNAの蓄積に
よるミトコンドリアエネルギー低下に耐性
を示し、２）逆に、ミトコンドリアでのエネ
ルギー産生に依存する遅筋は欠失型mtDNAの
蓄積に感受性を示すという２つの作業仮説
を検証することとした。 
 骨格筋線維は、筋分化の決定を受けた筋芽
細胞が機能的・生化学的に速筋と遅筋に最終
分化するため、細胞分化の典型として広く用
いられてきた材料である。マウスの骨格筋組
織はおおむね２種の速筋型線維（Types IIa 
とIIb線維）と１種の遅筋線維（Type I線維）
の混合筋である。本研究では、骨格筋を構成
する筋繊維の線維型を ATPase染色とミオシ
ン重鎖アイソフォームの抗体染色によって
識別した。 
 まず、多様な割合で欠失型mtDNAを含有す
るマウス群から前頚骨筋、大腿直筋、腓腹筋、
ヒラメ筋などを摘出し、Real-time PCR法と
ミトコンドリア呼吸酵素複合体IIとIVの生
体組織科学染色を実施し、欠失型mtDNAの蓄
積とミトコンドリア呼吸機能異常の関係を
調べた。 
 これらの結果をもとに、多様な割合で欠失
型mtDNAを含有するマウス群にインスリンシ
グナルを阻害することで糖の取り込みを低
下させる Wortmanninを腹腔投与し、速筋線
維での異常誘導と遅筋線維での更なる悪性
化誘導が起こるか、否かを検証した。この際、
骨格筋線維の糖の取り込みに寄与する
glucose transporter 4（GLUT4）の局在を免
疫組織化学的に調べた。 
 本研究は、筑波大学動物実験委員会から承
認された実験計画書をもとに、「動物の愛護
及び管理に関する法律」「実験動物の飼養及
び保管並びに苦痛の軽減等に関する基準」及
び「文部科学省基本指針（研究機関等におけ
る動物実験等の実施に関する基本指針）」等
の関連規則に沿って、実験動物マウスの飼育、
麻酔、処置、安楽死、さらには実験従事者の
健康維持にも配慮した実験体制のもと、実施
された。 
 
４．研究成果 
 本研究における成果は以下の通りである。 
 
１）欠失型 mtDNAを 導入したモデルマウス
から摘出した骨格筋組織の詳細解析から、
細胞質に存在する GLUT4の筋細胞膜直下
への移動と蓄積が欠失型 mtDNAに対する
抵抗性ならびに感受性と相関することが
明らかとなった。 
２）欠失型 mtDNAを 80%以上含有する骨格筋
組織において、slow oxidative type 1 と 
fast oxido- glycolytic type 2A/2X繊維
ではミトコンドリア呼吸機能異常が誘導
されていたが、fast glycolytic type 2B 
繊維では GULT4の筋細胞膜直下への移動
と蓄積が顕著に観察され、ミトコンドリア
呼吸機能が正常に維持されていた。このよ
うな結果から、細胞質に存在する GLUT4
の筋細胞膜直下への移動と蓄積が欠失型
mtDNAに対する抵抗性ならびに感受性と
相関していた。 
３）欠失型 mtDNAを含有するマウスに
Wortmanninを腹腔投与し、GLUT4の筋細胞
膜直下への移動と蓄積を阻害したところ、
欠失型 mtDNAの蓄積に感受性を示す slow 
oxidative type 1線維は、さらに、それ
らの病理が悪化し、ミトコンドリア病に典
型的な赤色ぼろ繊維（Ragged-red fibers: 
RRFs）の表現型を呈するようになった。 
４）興味深いことに、欠失型mtDNAの蓄積に
抵抗性を示すfast glycolytic type 2B 繊
維では、GLUT4の筋細胞膜直下への移動と
蓄積を阻害によってミトコンドリア呼吸
機能が低下し、一部の筋繊維がRRFsの病
理を呈するようになってしまった。すなわ
ち、これまで欠失型mtDNAの蓄積に対して
抵抗性を示していた筋繊維がインスリン
シグナルを化学的に遮断されると、欠失型
mtDNAの蓄積に対して感受性を示すよう
になり、欠失型mtDNAの病原性が発揮され
るようになることを示している。 
５）これらの結果は、GULT4 を介したインス
リンシグナルが異なった線維型を呈する
骨格筋線維間のおける変異型 mtDNAの病
原性制御に重要な役割を果たしているこ
とを示唆している。 
 
 mtDNAにはミトコンドリアでのエネルギー
産生（酸化的リン酸化反応：ミトコンドリア
呼吸機能）に関与する遺伝子群のみがコード
されているにも関わらず、mtDNA関連疾患の
病型と症度は多岐にわたることが知られて
いる。このパラドックスは、１）変異部位に
よる病原性の相違、２）変異型mtDNA分子の
臓器間局在と動態（変異型mtDNA分子の増加
や減少）の相違という、変異型mtDNA分子種
自体の病原性発揮に着目することによって
説明・考察されてきた。本研究では、このよ
うな組織特異的な変異型mtDNAの病原性発揮
機構ならびに病態の多様性の構築において、
「変異型mtDNAの蓄積に対する細胞種間の感
受性の差異」という新たな病理機構の存在を
実験動物学的に立証することに成功した。 
 変異型mtDNA分子種の蓄積によって発症す
るミトコンドリア病や関連疾患に対する治
療戦略は、病原性の突然変異の蓄積によって
減弱している電子伝達系を活性化する戦略
や、病原性の突然変異の蓄積によって電子伝
達の過程で過剰産生されてしまう活性酸素
種を低下または抑制させる戦略が主流であ
る。本研究では活用した欠失型mtDNAを導入
したモデルマウスでは、速筋線維では欠失型
mtDNAの病原性がほぼ発揮されない。この原
因である速筋線維における強靭なインスリ
ンシグナルとエネルギー代謝の転換・適応能
力を罹患組織に導入（再現）することが、変
異型mtDNA分子種の蓄積によって発症するミ
トコンドリア病や関連疾患に対する有効な
治療戦略になるかもしれない。 
 
５．主な発表論文等 
 
〔雑誌論文〕（計７件） 
① Tani H, Ohnishi S, Shitara H, Mito T, 
Yamaguchi M, Yonekawa H, Hashizume O, 
Ishikawa K, Nakada K, Hayashi JI. Mice 
deficient in the Shmt2 gene have 
mitochondrial respiration defects and 
are embryonic lethal. Scientific 
Reports, 8:425 (2018) （査読あり） 
② Yoshizumi T, Imamura H, Taku T, Kuroki 
T, Kawaguchi A, Ishikawa K, Nakada K, 
Koshiba T. RLR-mediated antiviral 
innate immunity requires oxidative 
phosphorylation activity. Scientific 
Reports, 7:5379 (2017) （査読あり） 
③Shimizu A, Tani H, Takibuchi G, Ishikawa 
K, Sakurazawa R, Inoue T, Hashimoto T, 
Nakada K, Takenaga K, Hayashi JI. 
Cytoplasmic transfer of heritable 
elements other than mtDNA from SAMP1 
mice into mouse tumor cells suppresses 
their ability to form tumors in C57BL6 
mice. Biochemistry and Biophysics 
Research Communications, 493:252-257 
(2017) （査読あり） 
④ Matsuhashi T, Sato T, Kanno SI, Suzuki 
T, Matsuo A, Oba Y, Kikusato M, 
Ogasawara E, Kudo T, Suzuki K, Ohara O, 
Shimbo H, Nanto F, Yamaguchi H, Saigusa 
D, Mukaiyama Y, Watabe A, Kikuchi K, 
Shima H, Mishima E, Akiyama Y, Oikawa Y, 
Hsin-Jung HO, Akiyama Y, Suzuki C, 
Uematsu M, Ogata M, Kumagai N, Toyomizu 
M, Hozawa A, Mano N, Owada Y, Aiba S, 
Yanagisawa T, Tomioka Y, Kure S, Ito S, 
Nakada K, Hayashi KI, Osaka H, Abe T. 
Mitochonic Acid 5 (MA-5) Facilitates 
ATP Synthase Oligomerization and Cell 
Survival in Various Mitochondrial 
Diseases. EBioMedicine, 20:27-38 
(2017) （査読あり） 
⑤ Borna NN, Kishita Y, Ishikawa K, Nakada 
K, Hayashi JI, Tokuzawa Y, Kohda M, 
Nyuzuki H, Yamashita-Sugahara Y, Nasu T, 
Takeda A, Murayama K, Ohtake A, Okazaki 
Y. A novel mutation in TAZ causes 
mitochondrial respiratory chain 
disorder without cardiomyopathy. 
Journal of Human Genetics, 62:539-547 
(2017) （査読あり） 
⑥ Lehtonen JM, Forsström S, Bottani E, 
Viscomi C, Baris OR, Isoniemi H, 
Höckerstedt K, Österlund P, Hurme M, 
Jylhävä J, Leppä S, Markkula R, Heliö T, 
Mombelli G, Uusimaa J, Laaksonen R, 
Laaksovirta H, Auranen M, Zeviani M, 
Smeitink J, Wiesner RJ, Nakada K, 
Isohanni P, Suomalainen A. FGF21 is a 
biomarker for mitochondrial 
translation and mtDNA maintenance 
disorders. Neurology, 87:2290-2299 
(2016) （査読あり） 
⑦ Suzuki T, Yamaguchi H, Kikusato M, 
Hashizume O, Nagatoishi S, Matsuo A, 
Sato T, Kudo T, Matsuhashi T, Murayama 
K, Ohba Y, Watanabe S, Kanno S, Minaki 
D, Saigusa D, Shinbo H, Mori N, Yuri A, 
Yokoro M, Mishima E, Shima H, Akiyama Y, 
Takeuchi Y, Kikuchi K, Toyohara T, 
Suzuki C, Ichimura T, Anzai J, Kohzuki 
M, Mano N, Kure S, Yanagisawa T, Tomioka 
Y, Toyomizu M, Tsumoto K, Nakada K, 
Bonventre JV, Ito S, Osaka H, Hayashi K, 
Abe T. Mitochonic Acid 5 Binds 
Mitochondria and Ameliorates Renal 
Tubular and Cardiac Myocyte Damage. 
Journal of American Society of 
Nephrology, 27:1925-32 (2016) （査読
あり） 
 
〔学会発表〕（計 ３件） 
①中田和人、ミトコンドリア・セントラルド
グマの破綻病理、The 7th Basic Science 
Seminar of Women’s Health Care、2017
年 
②中田和人、変異型ミトコンドリアゲノムに
よる多階層病理 、第39回日本分子生物学
会年会、2016年 
③中田和人、ミトコンドリアセントラルドグ
マの破綻病理、第16回日本抗加齢医学会
総会、2016年  
 
〔図書〕（計 １件） 
①小笠原絵美、中田和人 、突然変異型ミト
コンドリアゲノムを含有するモデルマウ
ス、医学のあゆみ、260: 73-79 (2016)  
 
〔その他〕 
ホームページ等 
http://www.biol.tsukuba.ac.jp/~jih-kzt/ 
 
６．研究組織 
(1)研究代表者 
  中田 和人（NAKADA, Kazuto） 
筑波大学・生命環境系・教授 
  研究者番号：８０３２３２４４ 
 


ミトコンドリアゲノム変異の病原性発揮における細胞種特異的な感受・抑制機構の解明

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ミトコンドリアゲノム変異の病原性発揮における細胞種特異的な感受・抑制機構の解明

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