Neuropeptides orexin-A and orexin-B, and their receptors OX1 and OX2 were first found as regulators of appetite, and later several other functions have been found as well. Orexin peptides and receptors have been researched, especially in the field of drug discovery; however many relevant biochemical properties remain partly unsolved, including the factors determining orexin ligand binding properties and ligand selectivity. The study of these factors was pursued in this thesis.
Ligand selectivity was studied with chimaeric orexin receptors. We mapped some of the molecular determinants of orexin receptors that are needed for the selectivity of orexin agonists and OX1-specific antagonist. The second quarter of the orexin receptors seems to be the most important area both for agonist and antagonist selectivity. However, for antagonist selectivity, the third quarter also seems to have a role.
Activated orexin receptors cause a strong elevation of intracellular calcium. However, reduction of extracellular calcium attenuates that increase and other orexin receptor signalling, mediated by certain phospholipases and kinases, for instance. It remains unknown, however, how calcium causes these effects. With [125I]-orexin-A, a clear decrease in binding was observed after reduction of the extracellular calcium concentration. Also, we saw a similar reduction in the activities of phospholipase C (PLC) and adenylyl cyclase (AC). The concentration-relationship of calcium was identical for radioligand binding, PLC activation, and AC stimulation, while AC inhibition was more strongly attenuated. When the driving force for calcium influx was reduced with high-K+ medium, the orexin-A-induced PLC activity was more strongly reduced than orexin-A binding. In addition, inhibition of the orexin receptor-operated calcium channels had a more pronounced effect on the PLC activity than on the binding. It is thus suggested that reduction of extracellular calcium concentration both inhibits orexin binding and attenuates enzymatic activity.
Orexin-B has higher binding affinity for OX2 than OX1 receptor and [Ala11, D-Leu15]-orexin-B, an orexin-B variant, has been reported to display even higher OX2-selectivity. We observed that [Ala11, D-Leu15]-orexin-B showed much lower OX2-selectivity than originally reported. In addition, the selectivity of both forms of orexin-B was dependent on the cell line. These findings may be caused by biased agonism of the orexin receptor, meaning that the orexin receptor can be found in multiple conformations, each of which can interact differently with an agonist. This result extends our knowledge of orexin ligand binding properties, and the phenomenon should be considered, for instance, when novel agonists for orexin receptors are screened.Neuropeptidien oreksiini-A ja oreksiini-B, ja niiden reseptoreiden OX1 ja OX2, löydettiin aluksi säätelevän ruokahalua, mutta myöhemmin niille on löydetty myös monia muita tehtäviä. Oreksiinipeptidejä ja -reseptoreita tutkitaan etenkin lääkekehityksessä, mutta silti monet tärkeät biokemialliset ominaisuudet, kuten ligandin sitoutumiseen ja selektiivisyyteen vaikuttavat tekijät, ovat osittain selvittämättä. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin näitä tekijöitä.
Ligandin selektiivisyyttä tutkittiin kimeerisillä reseptoreilla, joilla kartoitimme oreksiiniagonistien ja OX1-spesifisen antagonistin selektiivisyyteen tarvittavia alueita oreksiinireseptoreissa. Oreksiinireseptoreiden toinen neljännes näyttäisi olevan tärkein alue sekä agonistien että antagonistin selektiivisyydelle. Kuitenkin myös kolmannella neljänneksellä on merkitystä antagonistin selektiivisyydelle.
Oreksiinireseptorin aktivoituminen aiheuttaa solunsisäisen kalsiumin lisääntymisen. Tätä, ja mm. tiettyjen fosfolipaasien ja -kinaasien aktiivisuuta, voidaan heikentää vähentämällä solunulkoista kalsiumia. Ei ole kuitenkaan tiedossa, kuinka kalsiumi aiheuttaa nämä vaikutukset. Solunulkoisen kalsiumin vähentäminen vähensi selvästi [125I]-oreksiini-A:n sitoutumista. Vastaavasti, myös fosfolipaasi C:n (PLC) ja adenylaattisyklaasin (AC) aktiivisuudet vähenivät. Kalsiumin vähentäminen heikensi yhtä paljon radioligandin sitoutumista, PLC:n aktivaatiota ja AC:n stimulaatiota, kun taas AC:n inhibitio heikkeni enemmän. Kalsiumin sisäänvirtauksen vähentäminen puskurilla, jossa on paljon K+-ioneja, vähensi enemmän PLC:n aktivoitumista kuin oreksiini-A:n sitoutumista. Lisäksi reseptorin säätelemien kalsium kanavien inhibitiolla oli suurempi vaikutus PLC-aktiivisuuteen kuin sitoutumiseen. Täten vaikuttaisi siltä, että solunulkoisen kalsiumin vähentäminen estää sekä oreksiinin sitoutumista että entsymaattista aktiivisuutta.
Oreksiini-B:llä on korkeampi sitoutumisaffiniteetti OX2 kuin OX1 reseptoriin, ja oreksiini-B muunnoksen, [Ala11, D-Leu15]-oreksiini-B:n, on raportoitu olevan vielä enemmän spesifisempi OX2:lle. Huomasimme, että [Ala11, D-Leu15]-oreksiini-B:n OX2-selektiivisyys oli paljon matalampi kuin alun perin on raportoitu. Lisäksi, molempien oreksiini-B muotojen selektiivisyys riippui solulinjasta. Nämä havainnot voivat aiheutua siitä, että oreksiinireseptorilla voi olla useita eri rakenteita, joista kukin vuorovaikuttaa erilailla agonistin kanssa. Tulokset laajentavat tietämystämme oreksiinin sitoutumisominaisuuksista, ja ne pitäisi ottaa huomioon, esim. kun oreksiinireseptorille seulotaan uusia agonisteja
